劉廣建，鄭惠華，張 辰，蔣 益，薛 璟，桑 花，田貞樂，季宏更，張 蕾

（1.江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫214063；2.江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇南通226009）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）是麥角菌科（Clavicipitaceae）蟲草屬（Cordyceps）真菌。蛹蟲草子實體蛋白質(zhì)含量高，氨基酸種類齊全[1]；蛹蟲草蛋白中含有許多功能活性成分，如活性蛋白多肽、多糖肽等。食用菌活性蛋白具有提高人體免疫力、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗真菌等功效，藥用保健價值高[2-3]。目前食用菌蛋白的來源除了食用菌子實體蛋白，還可通過食用菌液體發(fā)酵獲得大量的菌絲體，并通過提純獲得菌絲蛋白。

蛹蟲草高通量發(fā)酵技術(shù)研究，主要是在菌絲快速生長階段，通過補料維持適宜的發(fā)酵條件，使菌絲持續(xù)快速生長。梁恒宇等[4]在產(chǎn)賴氨酸大腸桿菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的研究中，利用高通量生物反應(yīng)器，以在線監(jiān)測pH為直接反饋補料信號，以葡萄糖、氨水和硫酸銨混合溶液為流加液進行補料發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸，可使賴氨酸產(chǎn)量大幅提高。但此方式在蛹蟲草等大型食用菌液體發(fā)酵中還未見報道，而蛹蟲草高通量發(fā)酵可以在短時間內(nèi)獲得大量質(zhì)量穩(wěn)定、安全可靠的蛹蟲草菌絲體蛋白，可作為蛋白質(zhì)食品加工的來源。因此，試驗通過研究補料發(fā)酵中發(fā)酵液pH變化與還原糖消耗的關(guān)系，建立pH與還原糖的反饋信號，并進行分段補料發(fā)酵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

蛹蟲草菌株（SWAHcor-15003），江蘇省蘇微微生物研究有限公司通過常壓室溫等離子體（ARTP）誘變選育的高產(chǎn)菌絲體蛋白液體發(fā)酵菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母膏 0.8%、蛋白胨 0.6%、葡萄糖 2.0%，MgSO40.05%、KH2PO40.10%，維生素 B110 mg·L-1。

1.1.3 補料液

每3.5升補料液，含濃氨水96 mL、葡萄糖1 200 g、酵母膏360 g。

1.1.4 主要儀器和試劑

HYL-A全溫搖瓶柜，江蘇太倉強樂實驗設(shè)備有限公司；200 L液體發(fā)酵罐，江蘇鎮(zhèn)江江工生物成套設(shè)備有限公司；紫外可見分光光度計，上海譜元儀器有限公司；KT260定氮儀，福斯賽若分析儀器有限公司；25.0%～28.0%氨水，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)基的研究

運用響應(yīng)面分析法，試驗以酵母膏、蛋白胨、葡萄糖為發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)液進行單因素發(fā)酵研究，在單因素分析的基礎(chǔ)上利用Box-Benhnken方法進行3因素3水平試驗設(shè)計，以菌絲體生物量為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析得到優(yōu)化組合條件，試驗數(shù)據(jù)使用Excel進行整理和繪圖，同時利用Design-Expert 8.0統(tǒng)計分析軟件進行多元二次回歸模型方程的建立及方差分析，運用該軟件中響應(yīng)面值優(yōu)化程序求得當響應(yīng)面值最大時各因素的最佳組合。響應(yīng)面試驗因素水平見表1。

表1 最佳培養(yǎng)基的響應(yīng)面分析試驗因素水平Tab.1 Factors and levels of response surface analysis of the fittest medium

1.2.2 高通量液體發(fā)酵研究

1）未調(diào)控pH的蛹蟲草普通一段式液體發(fā)酵參數(shù)

試驗以500 mL搖瓶裝發(fā)酵液100 mL（響應(yīng)面分析得到的最佳培養(yǎng)基）進行蛹蟲草菌絲液體發(fā)酵，培養(yǎng)溫度26℃，轉(zhuǎn)速150 r·min-1?？疾觳煌瑫r間段發(fā)酵液pH、還原糖，菌絲體生物量及菌絲生長速率變化。

2）調(diào)控pH的蛹蟲草高通量液體發(fā)酵參數(shù)研究

蛹蟲草菌絲的最適生長 pH 為 5.4～6.8[5]，試驗以500 mL搖瓶裝發(fā)酵液100 mL（響應(yīng)面分析得到的最佳培養(yǎng)基）進行蛹蟲草菌絲液體發(fā)酵，根據(jù)不同時間段的pH，用濃氨水進行pH調(diào)控，將pH始終調(diào)控為5.8左右，考察不同時間還原糖、菌絲體生物量以及不同時間段的菌絲生長速率變化。

3）蛹蟲草高通量發(fā)酵的補料發(fā)酵研究

試驗以500 mL搖瓶裝發(fā)酵液100 mL（響應(yīng)面分析得到的最佳培養(yǎng)基）進行蛹蟲草液體發(fā)酵，通過pH監(jiān)控，在pH到達一定的值時加入補料液，其中濃氨水直接加入。試驗連續(xù)補料4次，考察還原糖、菌絲體生物量的變化，根據(jù)發(fā)酵液的濃稠程度調(diào)整搖床轉(zhuǎn)速，以找到蛹蟲草高通量液體發(fā)酵的最佳參數(shù)。

4）工業(yè)化蛹蟲草高通量補料發(fā)酵試驗

發(fā)酵試驗同時進行了工廠化普通一段式液體發(fā)酵和高通量補料發(fā)酵，考察2組發(fā)酵方式發(fā)酵情況。發(fā)酵罐（通氣加攪拌） 容積200 L，裝液量120 L，通氣量 1 ∶（0.5～1.0），壓差法接種，接種量為 8%，添加0.1%豆油作為消泡劑，25℃～26℃條件下培養(yǎng)。普通一段式液體發(fā)酵以攪拌轉(zhuǎn)速150 r·min-1發(fā)酵直至發(fā)酵結(jié)束；高通量補料發(fā)酵采用同樣發(fā)酵條件，開始時攪拌轉(zhuǎn)速150 r·min-1，根據(jù)發(fā)酵情況調(diào)整轉(zhuǎn)速，根據(jù)3） 搖瓶高通量發(fā)酵的最佳參數(shù)，進行工業(yè)化高通量補料發(fā)酵試驗，確定最佳發(fā)酵參數(shù)。

5）蛹蟲草菌絲體真蛋白檢測

工業(yè)化發(fā)酵的蛹蟲草菌絲體在離心、烘干后進行菌絲體蛋白測定時，因在補料發(fā)酵過程中使用了氨水，會使發(fā)酵液中含有許多銨鹽成分。試驗后菌絲體雖然進行了洗滌，但還是有可能吸附了一定量的銨鹽成分。直接凱氏定氮法檢測[6]，蛋白數(shù)值會偏高。試驗運用程淑華[7]真蛋白檢測方法進行菌絲體蛋白的測定，用氫氧化銅沉淀真蛋白，后用熱蒸餾水洗滌氨化含氮物，再用凱氏定氮法進行測定，連續(xù)3次重復(fù)測定。菌絲體蛋白含量（W，g·100-1mL-1）的計算公式如下：

式中：M為菌絲體生物量（g·100-1mL-1）；m為菌絲體蛋白得率（%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)基的確定

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計原理，以葡萄糖、蛋白胨、酵母膏3個因素為自變量，以蛹蟲草菌絲體生物量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法進行3因素3水平的試驗設(shè)計，共包括17組試驗方案，試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.2 Response surface test design scheme and results

利用設(shè)計軟件Design-Expert對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得二次多項回歸方程菌絲體生物量Y的計算公式：

式中：A為葡萄糖值、B蛋白胨值、C為酵母膏值。

回歸模型方程的ANOVA分析結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗回歸模型方差分析Tab.3 Variance analysis of response surface test regression model

由表3可知，擬合方程具有較高的F值（F=76.03） 和非常低的P值（P<0.000 1） 說明回歸方程達到極顯著水平（P<0.0001，R2=0.971 5）；失擬項的P=0.939 3＞0.05，試驗數(shù)據(jù)與模型預(yù)測數(shù)據(jù)差異不顯著，表明該擬合方程與實際擬合較好。另外設(shè)計軟件Design-Expert得出試驗結(jié)果相關(guān)系數(shù)模型的決定系數(shù)R2為0.971 5，表明菌絲體生物量的試驗值與預(yù)測值有較好的一致性，調(diào)整決定系數(shù)R2adj為0.976 9，說明該模型能解釋97.69%響應(yīng)值變化。該二次回歸模型擬合程度好，試驗誤差較小，可用該模型方程對液體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳條件預(yù)測和分析。

由F值可以看出3個因素對菌絲體生物量的影響程度由大到小依次為葡萄糖（A） ＞酵母膏（C） ＞蛋白胨（B）；由響應(yīng)面模型分析得出最佳的培養(yǎng)基參數(shù)為葡萄糖3.0%、蛋白胨0.4%、酵母膏1.0%，菌絲體生物量為1.644 0 g·100-1mL-1。

2.2 液體發(fā)酵參數(shù)試驗結(jié)果

不同時間段100 mL發(fā)酵液蛹蟲草菌絲生物量和菌絲生長速率的變化見圖1。

由圖1可看出，隨著時間的變化，菌絲體生物量不斷增加，但發(fā)酵末期生物量幾乎未有變化；調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH組的生物量一直比未調(diào)節(jié)pH的高，如在48 h時生物量相差0.155 g，但后期120 h時生物量相差僅0.05 g，在144 h發(fā)酵結(jié)束時生物量分別為1.612 g·100-1mL-1、1.615 g·100-1mL-1幾乎相同，說明發(fā)酵過程中調(diào)節(jié)適宜pH可以加快菌絲生長，但若不補充碳氮營養(yǎng)，發(fā)酵后期會隨著碳氮營養(yǎng)的消耗，總生物量將不再發(fā)生變化。調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH的蛹蟲草菌絲生長速率在0～72 h比未調(diào)節(jié)高，后期卻降低，說明需要補充碳氮營養(yǎng)，以提高菌絲的生物量；同時發(fā)現(xiàn)在整個發(fā)酵過程中，在48 h～72 h時間段蛹蟲草菌絲生長速率最高，調(diào)節(jié)pH和未調(diào)節(jié)pH分別達到 0.014 3 g·h-1、0.013 8 g·h-1。100 mL 發(fā)酵液補料時的pH及還原糖參數(shù)見圖2。

由圖2可看出，隨著時間的變化還原糖含量不斷減少，到后期幾乎未有變化。開始時發(fā)酵液的pH為5.22，100 mL發(fā)酵液加入40 μL濃氨水可調(diào)節(jié)pH到 5.80，48 h 后 pH 降至 4.15，加入氨水 80 μL 可調(diào)節(jié) pH為5.80。在發(fā)酵開始時的還原糖為 30.49 mg·mL-1，調(diào)節(jié)pH和未調(diào)節(jié)pH的發(fā)酵液48 h時的還原糖含量分別為17.97 mg·mL-1、18.82 mg·mL-1，128 h時分別為 2.68 mg·mL-1、3.06 mg·mL-1，在 48 h 碳源營養(yǎng)消耗約1/3。

由圖2可看出，在48 h快速生長階段初期進行補料，這時對應(yīng)的pH為4.10～4.20，發(fā)酵液還原糖在18 mg·mL-1左右，碳氮營養(yǎng)消耗1/3左右，因此在補料時考慮添加80 μL氨水調(diào)節(jié)pH和添加1/3的碳氮營養(yǎng)即100 mL發(fā)酵液添加1.0 g葡萄糖、0.3 g酵母膏，氨水可代替部分氮源。

2.3 蛹蟲草高通量發(fā)酵的補料發(fā)酵研究

在發(fā)酵參數(shù)研究的基礎(chǔ)上分別進行搖瓶及發(fā)酵罐補料發(fā)酵研究，發(fā)酵開始，搖瓶用40 μL氨水調(diào)節(jié)pH，發(fā)酵罐用50 mL氨水調(diào)節(jié)pH，pH在4.10～4.20，發(fā)酵液還原糖含量約18 mg·mL-1時進行補料，每次補料時調(diào)節(jié)pH為5.8；每次補料每瓶搖瓶加3 mL補料液，發(fā)酵罐加3.5 L補料液。開始搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1，第 2 次補料時轉(zhuǎn)速 180 r·min-1，第 4 次補料時轉(zhuǎn)速220 r·min-1，直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵罐開始攪拌時轉(zhuǎn)速180 r·min-1，第2次補料時轉(zhuǎn)速220 r·min-1，第 4 次補料時轉(zhuǎn)速 300 r·min-1，直至發(fā)酵結(jié)束。搖瓶補料發(fā)酵情況見表4。

表4 搖瓶補料發(fā)酵情況表Tab.4 Resuts of supplementary fermentation in shake-flask

由表4可看出，pH 在 4.10～4.20時，發(fā)酵液還原糖含量約18 mg·mL-1，說明發(fā)酵補料的時間點及補料的碳氮營養(yǎng)比例適宜，搖瓶發(fā)酵結(jié)束時菌絲體生物量為2.316 g·100-1mL-1，比未補料發(fā)酵菌絲體生物量 1.612 g·100-1mL-1提高了 43.8%，因此以該參數(shù)進行發(fā)酵罐的高通量補料發(fā)酵研究。200 L發(fā)酵罐補料發(fā)酵情況見表5。

表5 200 L發(fā)酵罐補料發(fā)酵情況Tab.5 Resuts of supplementary fermentation in 200 L fermentation tank

由表5發(fā)酵罐數(shù)據(jù)可知，搖瓶及發(fā)酵罐補料發(fā)酵的數(shù)據(jù)有一致性。在 pH 4.10～4.20，對應(yīng)發(fā)酵液還原糖18 mg·mL-1左右時進行補料發(fā)酵，發(fā)酵69 h就可結(jié)束發(fā)酵，菌絲體生物量為2.362 g·100-1mL-1，達到了高通量發(fā)酵的理想結(jié)果。

2.4 蛹蟲草菌絲體真蛋白檢測

200 L發(fā)酵罐蛹蟲草發(fā)酵液，直接運用凱氏定氮法測定菌絲體蛋白得率達到51.43%。采用真蛋白檢測方法[7]，菌絲體蛋白質(zhì)得率為46.5%。搖瓶及發(fā)酵罐一段發(fā)酵與補料發(fā)酵情況對照情況見表6。

表6 搖瓶及發(fā)酵罐一段發(fā)酵與補料發(fā)酵情況對照表Tab.6 Comparison of ordinary fermentation and supplementary fermentation in shake-flask and fermentation tank

由表6發(fā)酵數(shù)據(jù)可知，普通一段發(fā)酵主要考察發(fā)酵參數(shù)，了解菌絲生長狀況，為高通量發(fā)酵提供介入點，同時發(fā)酵參數(shù)又可作為高通量發(fā)酵的對照。200 L發(fā)酵罐工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)高通量液體發(fā)酵，發(fā)酵時間69 h，比普通一段式發(fā)酵時間縮短3 h；菌絲體蛋白含量達到1.098 g·100-1mL-1，比普通一段式發(fā)酵菌絲體蛋白含量 （0.651 g·100-1mL-1）提高 68.92%[8]。

3 討論與結(jié)論

已有研究中，微生物可通過流加、分段補料等方式進行液體高通量發(fā)酵，均取得了理想的成果，梁恒宇等[4]的研究結(jié)果表明，在賴氨酸發(fā)酵的不同階段采用不同配比的流加液進行分段式培養(yǎng)可以進一步提高賴氨酸的產(chǎn)酸濃度，同時降低殘?zhí)呛蜌堜@氮含量。三段式pH反饋補料發(fā)酵可以將賴氨酸產(chǎn)酸濃度提高到 （56.85±0.98） g·L-1，與二段式和一段式相比分別提高8.65%和23.64%。項目組根據(jù)單位現(xiàn)有發(fā)酵條件，采用分段式高通量液體發(fā)酵方式進行了蛹蟲草的液體發(fā)酵研究。試驗通過響應(yīng)面分析法得到了最佳培養(yǎng)基為葡萄糖3.0%、蛋白胨0.4%、酵母膏 1.0%，MgSO40.05%、KH2PO40.10%、維生素 B110 mg·L-1。通過蛹蟲草高通量發(fā)酵研究得到最佳發(fā)酵參數(shù)為200 L發(fā)酵罐每次補液量3.5 L（包含濃氨水96 mL、葡萄糖1 200 g、酵母膏360 g），在38 h、42 h、48 h、54 h進行4次補料，整個發(fā)酵結(jié)束時間 69 h，菌絲體生物量 2.36 g·100-1mL-1，菌絲體蛋白得率 46.5%，菌絲體蛋白含量 1.098 g·100-1mL-1，比普通發(fā)酵菌絲體蛋白含量提高68.92%。

蛹蟲草SWAHcor-15003誘變高蛋白菌株在普通一段式發(fā)酵菌絲體蛋白得率為40.9%[8]，而通過補料進行的高通量發(fā)酵后蛋白含量有一定的增加，說明在發(fā)酵過程通過添加氨水調(diào)節(jié)pH及補料發(fā)酵可提高發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量；通過對pH、還原糖等一些發(fā)酵參數(shù)的實時監(jiān)控，以pH及還原糖為反饋數(shù)據(jù)進行食用菌高通量液體發(fā)酵的方式證明可行，后續(xù)可進行食用菌流加補料高通量發(fā)酵的相關(guān)研究。