苗雨欣，劉 旭，寧慧娟，葛鑫會，張京聲，孫君社，張秀清

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

靈芝 （Ganoderma lucidum） 屬擔(dān)子菌綱 （Basidiomycetes） 多孔菌目 （Aphyllophorales） 多孔菌科（Polyporaceae）靈芝屬（Ganoderma Karst.）真菌，在我國已有2 000多年藥用歷史。靈芝含有多種活性物質(zhì)如三萜、多糖、生物堿和甾醇等[1-2]，其中靈芝多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖及免疫調(diào)節(jié)等作用[3-9]。靈芝子實體主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，質(zhì)地堅硬，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，導(dǎo)致靈芝多糖難以溶出，常規(guī)的水提醇沉法得率相對較低[10]，超聲波法、微波法、酶提取法可以提高多糖得率[11-13]，但提取成本高，操作復(fù)雜；堿提法或酸提法提取多糖，如趙琪[14]采用強酸性電解水提取靈芝多糖，結(jié)合擠壓膨化技術(shù)預(yù)處理，靈芝多糖的得率可達6.90%，但多糖易發(fā)生降解，且操作易腐蝕設(shè)備、污染環(huán)境；而電解水作為提取溶劑則可避免上述方法的缺點。由于電解水具有較高的溶解性、較小分子簇等特點[15-16]，與堿提法相比具有成本低廉、不污染環(huán)境、不腐蝕設(shè)備等優(yōu)點，因此，試驗通過堿性電解水提取靈芝子實體多糖，以探討堿性電解水提取靈芝多糖的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選用來源于陜西漢中栽培基地的大段木赤靈芝。葡萄糖、木糖購于Sigma公司；濃硫酸、苯酚、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑。

試驗所用電解槽為自制常規(guī)雙槽隔膜式電解槽（40 cm×20 cm×20 cm），隔膜選用陽離子交換膜；極板為涂釕鈦網(wǎng)，極板距離固定10 cm；外界變壓調(diào)節(jié)器（0～220 V）；純鈦板：北京中北鈦業(yè)有限公司；異相離子交換膜：上?；S；Agilent 1200高效液相色譜儀：Agilent科技有限公司；TU-1901雙光束紫外分光光度計：北京普析通用儀器廠；CypherS原子力顯微鏡：Asylum Reaserch公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 靈芝粗多糖的提取

將靈芝子實體粉碎后過40目篩，以5∶1（mL∶g）比例加入一定體積的石油醚，60℃水浴3 h脫脂，以1∶5（g∶mL） 比例加入95%的乙醇水浴3 h，并調(diào)節(jié)所得提取液pH，4 000 r·min-1離心15 min，取上清液加入4倍體積無水乙醇，4℃保存過夜；8 000 r·min-1離心10 min棄上清液，沉淀則為粗多糖。粗多糖60℃烘干后溶于蒸餾水，定容至50 mL，準(zhǔn)確吸取靈芝多糖提取液1 mL制備待測樣液。使用苯酚-硫酸法測定多糖含量[17]。多糖得率（w，%） 測定公式為：

式中：m0為多糖含量（g）；m 為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.2 電解水的制備

在電解槽陽極加入NaCl溶液（10 g·L-1），陰極加少量NaCl（0.01 g·L-1），電壓維持在20 V左右，電解15 min～150 min得到不同pH的電解水。

1.2.3 靈芝子實體多糖含量及得率測定

準(zhǔn)確稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖1.0 g，用去離子水定容至100 mL，取1 mL該溶液定容至100 mL，配成 0.1 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分別置于試管中加去離子水補充體積至2.0 mL；再各加入 5%的苯酚 1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL；靜置10 min后，搖勻，待反應(yīng)液完全冷卻，于波長490 nm條件下測定其吸光度值，水為空白對照。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

由圖1所示，根據(jù)葡萄糖對照品含量與吸光度值的線性關(guān)系得回歸方程 y=7.801 2x+0.001 8，R2=0.999 9，說明葡萄糖含量與吸光值的線性關(guān)系良好。

1.3 靈芝子實體多糖堿性電解水提取工藝的單因素試驗

經(jīng)多次預(yù)試驗，選取料液比、電解水pH、提取溫度和水浴提取時間4個因素，考察單因素對靈芝子實體多糖提取率的影響。按照靈芝子實體多糖提取流程 1.2.1 操作，料液比 （g∶mL） 選取 1 ∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55、1∶65、1∶75，電解水溶液 pH 選取 8.5、9.5、10.5、11.5、12.5，提取溫度選取60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，以上3個單因素試驗時，水浴提取時間設(shè)置為60 min。水浴提取時間選取 15 min、35 min、55 min、75 min、95 min、115 min、135 min和155 min，確定最佳提取條件。

1.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗結(jié)果，選取料液比（A）、電解水pH（B）、水浴提取時間（C） 3個因素，以靈芝多糖的含量為響應(yīng)值（Y），在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法。

1.5 原子力顯微鏡觀察

原子力顯微鏡是在掃描隧道電子顯微鏡基礎(chǔ)上發(fā)展起來的物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析方法，已成為驗證高分子結(jié)構(gòu)的一種重要工具[18]。以試驗1.2.1水提法提取的靈芝多糖為對照，將水提和最優(yōu)條件電解水提取的靈芝多糖固體樣品用去離子水溶解至0.01 mg·mL-1，再吸取5 μL～10 μL于云母片上晾干后固定，進行AFM測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同單因素對靈芝子實體多糖得率的影響

不同單因素對多糖提取率的影響見圖2。

如圖2所示，料液比對靈芝多糖的提取有一定影響，靈芝多糖的含量隨料液比的增大呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在電解水pH12.5、提取溫度100℃、提取時間60 min條件下，當(dāng)料液比達到 1∶45（g∶mL） 時，靈芝多糖得率較高，達2.89%，繼續(xù)增加溶劑用量效果不顯著，會造成溶劑損耗。

料液比確定的條件下，靈芝多糖得率隨電解水pH的增加而增加，堿性電解水對靈芝多糖的得率有顯著提高（P<0.05）。在料液比為1∶45、提取溫度為100℃、提取時間為60 min條件下，當(dāng)電解水pH為12.5時，多糖得率最高，為pH 8.5所獲得多糖含量的1.65倍。推測在堿性電解水的作用下，隨著電解水pH的逐漸升高，靈芝子實體中木質(zhì)素溶出增加、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞程度也逐漸加大，使得電解水可更充分地進入靈芝子實體的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中，從而提高靈芝多糖提取率。但是由于電解水制備pH極限為12.5，綜合實際因素，選擇pH 12.5電解水作為下一步提取方法優(yōu)化溶劑。

在料液比為 1∶45（g∶mL），電解水 pH 12.5，浸提時間60 min條件下，隨著提取溫度的升高，靈芝多糖含量不斷增加，100℃時含量最高。

當(dāng)提取時間達到95 min時，靈芝多糖得率較高，為3.09%；當(dāng)提取時間達135 min時，多糖得率顯著下降，可能是由于多糖在溶液中浸提時間過長，造成多糖結(jié)構(gòu)被破壞[19]。

2.2 子實體多糖堿性電解水提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，基于降低提取溫度后顯著降低了多糖提取率，后續(xù)工藝優(yōu)化中直接選100℃即沸水浴作為提取溫度。選取料液比、電解水pH、沸水浴提取時間3因素進行響應(yīng)面分析法優(yōu)化靈芝子實體多糖的提取工藝。試驗因素與水平設(shè)計見表1，試驗方案設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 靈芝多糖堿性電解水提工藝響應(yīng)面分析因素與水平Tab.1 Levels and factors used in the response surface design

用Design-expert 8.0對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行分析，建立料液比（A）、電解水pH（B）、沸水浴提取時間（C）3因素數(shù)字回歸模型為：

表2 靈芝多糖提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析Tab.2 The results for response surface methodology of alkaline electrolysed water extraction Ganoderma lucidum polysaccharides

其回歸方差分析結(jié)果見表3。由表3可以看出，一次項中，A（料液比）和B（電解水的pH）對多糖得率的線性效應(yīng)極顯著（P<0.01），C（提取時間）對多糖含量的線性效應(yīng)不顯著（P>0.05），二次項中，C2影響極顯著 （P<0.01），AB、A2影響顯著 （P<0.05），AC、BC、B2、C2影響不顯著。此模型顯著性檢測P值為0.000 3，模型極顯著。失擬項P值0.062 8>0.05，差異不顯著，校正模型的相關(guān)系數(shù)R2值為0.965 6，決定系數(shù)R2Adj值為0.921 4，表明所選用的二次回歸模型與實際情況擬合較好，誤差小，能較好反應(yīng)各因素與靈芝多糖得率之間關(guān)系。由F值可知，在試驗范圍內(nèi)各因素對靈芝多糖得率的影響大小依次為B（電解水pH） >A（料液比）>C（提取時間）。

2.2.2 靈芝子實體提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化與分析

采用Design-Expert 8.0軟件處理得到響應(yīng)面分析結(jié)果見圖3。如圖3所示，響應(yīng)面曲線梯度反映各因素對靈芝多糖提取率的影響大小，曲線越陡則表示該因素對靈芝多糖提取率影響越明顯。圖3A為固定沸水浴提取時間得到交互作用顯著的料液比和電解水pH響應(yīng)面圖，圖形的走勢極其陡峭，表明料液比和電解水pH交互作用顯著，這也與方差分析結(jié)果一致。圖3B為固定料液比得到的電解水pH和沸水浴提取時間交互作用響應(yīng)面圖，靈芝多糖提取率隨著電解水pH的增加而上升，當(dāng)電解水pH為12.5時，多糖得率最高。由此推測，較高pH的電解水提取有助于減輕細(xì)胞壁聚合物分子間的物理和化學(xué)作用，使不溶性纖維素、木質(zhì)素、半纖維素與果膠多糖之間的化學(xué)鍵斷裂，從而提高多糖提取率，但過高的堿濃度反而會引起多糖結(jié)構(gòu)的破壞。圖3C為固定電解水pH得到的沸水浴提取時間與料液比交互作用的響應(yīng)面圖，隨著沸水浴提取時間的增加，多糖提取率增大，當(dāng)提取時間增加到約95 min后，繼續(xù)延長沸水浴提取時間，多糖提取率反而下降，這可能是由于提取時間過長，造成多糖分解。

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析Tab.3 Analysis of variance for the fitted regression model

2.2.3 驗證試驗結(jié)果

通過回歸模型的分析，確定靈芝子實體多糖堿性電解水提工藝的參數(shù)為：料液比1∶60（g∶mL），電解水pH 12.5，沸水浴提取時間 105.63 min。在此條件下模型預(yù)測靈芝子實體多糖的提取率為3.0%。為方便實際操作，將工藝條件調(diào)整為：料液比1∶60（g∶mL），電解水 pH 12.5，沸水提取時間 105 min，最終測得靈芝多糖的提取率為（3.11±0.10）%，與理論預(yù)測值的誤差為0.11%。與水提法（提取率為1.78%）相比，堿性電解水提靈芝多糖的提取率提高了74.72%。說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的多糖提取工藝參數(shù)可靠，具有一定的應(yīng)用參考價值。

2.3 靈芝子實體多糖AFM分析

通過對分散在云母片上的2種靈芝多糖進行觀察和檢測，見圖4。由圖4可知，靈芝多糖均呈現(xiàn)球形或棒狀結(jié)構(gòu)，這些大顆粒被認(rèn)為是多糖分子聚集形成，推測多糖可能呈緊湊的卷曲構(gòu)象。水提靈芝多糖分子長度為225 nm～255 nm（圖4A），高度2.1 nm～3.7 nm （圖4C），而堿性電解水提取得到的多糖分子長度為314 nm～372 nm（圖4B），高度為2.8 nm～4.3 nm （圖 4D），二者形態(tài)相似，后者分子略大。羊肚菌多糖的原子力顯微鏡觀察顯示其為鏈狀與帶有裂紋球形體，鏈高0.53 nm～1.34 nm，寬度為40 nm，球形體直徑約為50 nm～100 nm[20]。這顯示食用菌類多糖的分子大小和形態(tài)具有一定的規(guī)律。

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗，確定了靈芝多糖的最佳提取條件為電解水pH 12.5，料液比1∶60（g∶mL），沸水浴提取時間105 min。在此工藝下，與傳統(tǒng)水提法相比，堿性電解水提取靈芝多糖的得率提高了74.72%。水提靈芝多糖分子長度為225 nm～255 nm，高度 2.1 nm～3.7 nm，而堿性電解水提取得到的多糖分子長度為314 nm～372 nm，高度為2.8 nm～4.3 nm。堿性電解水提取得到的多糖分子略大，其具體結(jié)構(gòu)組成和生理活性有待進一步分析。