范向?qū)帯?柯　朱久育　王 磊　趙清娟　劉 剛　黃艷麗

[關(guān)鍵詞]炎癥;肥胖;肝臟;胰島素;胰島素抵抗;大鼠

[中圖分類號(hào)]R365.4? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2021）12-0102-03

Effects of Inflammatory Factors on Insulin Signal Pathway in Liver Tissue

of Obese Rats

FAN Xiang-ning，LIU Ke，ZHU Jiu-yu，WANG Lei，ZHAO Qing-juan，LIU Gang，HUANG Yan-li

（Department of Stomatology，the Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Xinxiang 453000，Henan，China）

Abstract： Objective? The aim of this study was to study the effect of obesity on IR associated with signal pathways in liver. Methods? Ten male SD rats were randomly divided in 2 groups： control group （Con） （fed with standard diet）; high-fat diet group （HFD） （fed with high fat diet）. The animal model was characterized in terms of body weight （BW） and Lee index. The mRNA levels of tumor necrosis factors ɑ （TNF-ɑ）， interleukin-1beta （IL-1β）， Toll-like receptor 2 （TLR2） and Toll-like receptor 4 （TLR4）， insulin receptor， phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）， protein kinase B （AKT） and glucose transporter type 4 （GLUT4） were measured by quantitative real-time polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results? Compared with the control group， the TNF-α gene level in the liver tissue of the experimental group was significantly increased， and the difference was statistically significant （P<0.05）. At the same time， the mRNA levels of IL-1β and TLR4 were significantly decreased （P<0.05）. Compared with the control group， the expression of IR， PI3K， AKT and GLUT4 genes in the liver tissue of the experimental group was significantly reduced （P<0.05）. Conclusions? In obese rats， the insulin signal pathway was inhibited in liver tissue， which is associated with the onset or development of IR.

Key words： inflammation; obesity; liver; insulin; insulin resistance; rat

近年來(lái)，肥胖及肥胖相關(guān)的內(nèi)分泌失調(diào)性疾病已經(jīng)成為全球性問(wèn)題[1]。肥胖可以導(dǎo)致免疫細(xì)胞浸入脂肪組織并分泌促炎因子，如腫瘤壞死因子-ɑ（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）[2]等，促進(jìn)慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展。研究表明，TNF-ɑ可以損害胰島素信號(hào)通路，在脂肪細(xì)胞和外周組織中誘導(dǎo)胰島素抵抗，從而導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生[3]。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是檢測(cè)微生物成分和激活免疫反應(yīng)的模式識(shí)別受體。Toll樣受體2（Toll-like receptor2，TLR2）和Toll樣受體4（Toll-like receptor4，TLR4）位于細(xì)胞膜表面，在免疫炎癥和代謝性疾病的相互作用中發(fā)揮重要作用[4]。TLRs在炎癥和胰島素抵抗的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。本研究是探究炎癥因子對(duì)肥胖大鼠肝臟組織的胰島素信號(hào)通路的影響研究。

1? 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源：PF級(jí)SD大鼠，雄性，8周齡，購(gòu)自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（SCXK2007-0001），常規(guī)飼養(yǎng)于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房，自由飲水和進(jìn)食，飼養(yǎng)溫度為20℃～24℃，晝夜節(jié)律同自然。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料，實(shí)驗(yàn)組喂養(yǎng)高脂飼料，一共喂養(yǎng)9周，然后進(jìn)行各相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。需要注意的是，每周都需要對(duì)大鼠進(jìn)行體重（Body weight，BW）、體長(zhǎng)（naso-anal length，NAL）測(cè)量。利用公式計(jì)算出Lee指數(shù)[6]。

1.3 ELISA檢測(cè)：所有大鼠禁食過(guò)夜，4%水合氯醛腹腔注射使動(dòng)物全麻，通過(guò)心臟穿刺的方法收集血樣，使用鼠胰島素試劑盒量化空腹胰島素水平。血糖測(cè)量?jī)x檢測(cè)葡萄糖水平。用HOMA指數(shù)評(píng)價(jià)大鼠的胰島素敏感性。公式如下：[HOMA-IR]=空腹血清葡萄糖（mg/dl×空腹血清胰島素（μU/ml）/22.5。

1.4 相關(guān)基因的RT-PCR檢測(cè)：Trizol提取組織總mRNA，參照First Strand cDNA Synthesis kit合成試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）。RT-PCR所用引物由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95℃5s，60℃30s，40個(gè)循環(huán);溶解曲線為95℃15s，60℃1min，95℃15s。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有樣本的數(shù)量在3～5個(gè)，數(shù)值為（xˉ±s），使用Graph Pad Primer 7.0軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)分析使用t檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 各組大鼠的體重及Lee指數(shù)：飼料喂養(yǎng)9周后，與對(duì)照組大鼠相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠的體重及Lee指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 空腹血糖、空腹胰島素水平及HOMA-IR：禁食過(guò)夜后，血清檢測(cè)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組大鼠的空腹血糖水平與對(duì)照組大鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;空腹胰島素水平和HOMA-IR在實(shí)驗(yàn)組大鼠中的表達(dá)較對(duì)照組大鼠的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.3 肝臟組織中炎癥因子的表達(dá)：為了檢測(cè)大鼠肝組織的炎癥反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了TNF-ɑ、IL-1β、TLR2、TLR4的mRNA水平的表達(dá)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟組織中TNF-ɑ的mRNA水平顯著升高（P=0.0047），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，與對(duì)照組相比，IL-1β（P=0.0013）和TLR4（P=0.0161）的mRNA水平分別顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

2.4 肝臟組織中胰島素信號(hào)通路的表達(dá)：胰島素信號(hào)通路先前已有描述[12]。胰島素可以通過(guò)胰島素受體（Insulin receptor，IR）依次激活胰島素受體底物（Insulin receptor substrate，IRS）、磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidyl inositol kinase 3，PI3K）、蛋白激酶B（AKT）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（Glucose transporters 4，GLUT4），導(dǎo)致GLUT4定位于細(xì)胞膜。肝臟在維持血糖水平及身體功能方面起著重要作用。PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，IR（P=0.0003）、PI3K（P=0.0061）、AKT（P=0.0004）和GLUT4（P=0.0033）基因表達(dá)分別顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

3? 討論

肥胖被不僅被認(rèn)為是脂肪肝的危險(xiǎn)因素，同時(shí)與2型糖尿病也具有一定相關(guān)性。脂肪的大量堆積可以引起脂肪組織和肝臟組織的代謝異常，從而引起脂肪和肝臟的胰島素抵抗[7]。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料喂養(yǎng)的方法，來(lái)構(gòu)建肥胖并伴有胰島素抵抗的大鼠模型。高脂飼料喂養(yǎng)大鼠9周之后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得Lee指數(shù)和禁食過(guò)夜后大鼠的空腹血糖、空腹胰島素及HOMA-IR水平的相關(guān)數(shù)據(jù)可知，本研究成功構(gòu)建了肥胖伴有胰島素抵抗大鼠模型。

TNF-α是一種由脂肪細(xì)胞和炎癥細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，與肥胖和2型糖尿病的發(fā)生相關(guān)。近期一項(xiàng)臨床研究表明，肥胖伴2型糖尿病患者的血清中TNF-α水平明顯升高[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠的肝臟組織中TNF-α的基因水平明顯升高。因此，我們推測(cè)肥胖可能通過(guò)上調(diào)肝臟組織中TNF-α分泌，從而影響肝臟代謝功能。

GLUT4是一種胰島素調(diào)節(jié)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通常在低胰島素條件下發(fā)現(xiàn)于脂肪和肌肉細(xì)胞中。然而，高水平的胰島素可以誘導(dǎo)胞內(nèi)小泡的GLUT4向質(zhì)膜移位，增加細(xì)胞攝取更多葡萄糖[9]。PI3K在胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取中起重要作用。大量研究表明，PI3K/AKT信號(hào)通路是正常代謝所必需的，并且其不平衡導(dǎo)致肥胖和2型糖尿病的發(fā)生[10]。PI3K由IRS上調(diào)，胰島素受體底物結(jié)合并激活其下游效應(yīng)因子AKT，導(dǎo)致GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜。GLUT4在胰島素誘導(dǎo)的肌肉和脂肪組織葡萄糖提取中起關(guān)鍵作用。在糖尿病前期和糖尿病中，GLUT4的表達(dá)/易位被檢測(cè)到減少，參與了損害血糖控制的機(jī)制[11]。身體各種組織中受損的PI3K/AKT信號(hào)通路可以導(dǎo)致肥胖和2型糖尿病，進(jìn)而引起胰島素抵抗;反之，胰島素抵抗可以抑制PI3K/AKT途徑，形成惡性循環(huán)[12]。PI3K/AKT信號(hào)通路與肝臟胰島素相關(guān)，綠色巴西棕櫚提取物可以通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而提高胰島素敏感度，改善肝臟胰島素抵抗[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)大鼠中肝臟組織中胰島素受體、PI3K、AKT和GLUT4基因表達(dá)顯著降低。因此，筆者推測(cè)：高脂飲食喂養(yǎng)，可以促進(jìn)肝臟組織中TNF-α的表達(dá)，進(jìn)而抑制PI3K、AKT、GLUT4的表達(dá)，從而引發(fā)胰島素抵抗。炎癥因子介導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路在胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，這為胰島素抵抗的治療提供了新的治療思路。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示長(zhǎng)期高脂飲食可以通過(guò)抑制胰島素相關(guān)信號(hào)通路，降低肝臟組織對(duì)胰島素敏感度，從而誘發(fā)大鼠胰島素抵抗。但是關(guān)于肝臟組織在胰島素抵抗中發(fā)揮的作用還需要進(jìn)一步探究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Yang Y，Shields GS，Guo C，et al.Executive function performance in obesity and overweight individuals：a meta-analysis and review[J].Neurosci Biobehav Rev，2018，84：225.

[2]Hsieh CC，Wang YF，Lin PY，et al.Seed peptide lunasin ameliorates obesity-induced inflammation and regulates immune responses in C57BL/6J mice fed high-fat diet[J].Food Chem Toxicol，2021，147：111908.

[3]Akash MSH，Rehman K，Liaqat A.Tumor necrosis factor-alpha：role in development of insulin resistance and pathogenesis of Type 2 diabetes mellitus[J].J Cell Biochem.2018，119（1）：105-110.

[4]Huang YL，Zeng J，Chen GQ，et al.Periodontitis contributes to adipose tissue inflammation through the NF-<kappa>B，JNK and ERK pathways to promote insulin resistance in a rat model[J].Microbes Infect，2016，18（2）：804.

[5]Benomar Y，Taouis M.Molecular mechanisms underlying obesity-induced hypothalamic inflammation and insulin resistance： pivotal role of resistin/TLR4 pathways [J].Front Endocrinol（Lausanne），2019，10（3）：140.

[6]Huang YL，Guo WH，Zeng J，et al.Prediabetes enhances periodontal inflammation consistent with activation of TLR mediated NF-кB pathway in rats[J].J Periodontol，2016，87（5）：e64.

[7]Yaz?c? D，Sezer H.Insulin resistance， obesity and lipotoxicity [J].Adv Exp Med Biol，2017，960（5）：277-304.

[8]Alzamil H.Elevated serum TNF-α is related to obesity in Type 2 diabetes mellitus and is associated with glycemic control and insulin resistance[J].J Obes，2020，30（1）：5076858.

[9]James DE，Brown R，Navarro J，et al.Insulin-regulatable tissues express a unique insulin-sensitive glucose transport protein[J].Nature，1988， 333（6169）：183-185.

[10]Huang X，Liu G，Guo J，et al.The PI3K/AKT pathway in obesity and Type 2 diabetes[J].Int J Biol Sci，2018，14（11）：1483-1496.

[11]Esteves JV，Enguita FJ，Machado UF.MicroRNAs-Mediated regulation of skeletal muscle GLUT4 expression and translocation in insulin resistance[J].J Diabetes Res，2017：7267910.

[12]Huang X，Liu G，Guo J，et al.The PI3K/AKT pathway in obesity and type 2 diabetes [J].Int J Biol Sci，2018，14（11）：1483.

[13]Mazibuko-Mbeje SE，Dludla PV，Roux C，et al.Aspalathin-enriched green rooibos extract reduces hepatic insulin resistance by modulating PI3K/AKT and AMPK pathways[J].Int J Mol Sci，2019，20（3）：E633.

[收稿日期]2020-10-15

本文引用格式：范向?qū)?，劉柯，朱久育，?炎癥因子對(duì)肥胖大鼠肝臟組織胰島素信號(hào)通路的影響研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2021，30（12）：102-104.