張旭升，李曉娟

(甘肅省第二人民醫(yī)院：1.普外科；2.內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730000)

急性重癥胰腺炎(SAP)屬普外科常見(jiàn)急腹癥，常因膽總管結(jié)石嵌頓或Oddish括約肌痙攣所致。約20%的急性胰腺炎患者可進(jìn)展為SAP，若不及時(shí)干預(yù)還可引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征等[1-2]。以往多采用手術(shù)清除壞死組織治療SAP，但開(kāi)腹手術(shù)較難徹底清除胰腺及胰周壞死組織，且可能引發(fā)內(nèi)環(huán)境紊亂，增加發(fā)生大出血、腹腔感染等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)[3]。故近年來(lái)，臨床多推薦給予非手術(shù)治療。有研究證實(shí)，區(qū)域動(dòng)脈灌注在SAP治療中效果較理想，可經(jīng)胰腺病變部位供血?jiǎng)用}置入導(dǎo)管，通過(guò)導(dǎo)管輸注治療藥物，使胰腺局部藥物濃度提升，達(dá)到治療的目的[4]。但國(guó)內(nèi)就SAP區(qū)域動(dòng)脈灌注治療的相關(guān)研究仍較少，特別是對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡分析的相關(guān)研究較少，且受實(shí)驗(yàn)性模型動(dòng)物血管分離難度大、臨床影像學(xué)支持不夠等因素影響，仍缺乏合理、規(guī)范的實(shí)驗(yàn)性區(qū)域動(dòng)脈灌注模型。此外，動(dòng)脈藥物選擇也是影響SAP區(qū)域動(dòng)脈灌注治療的關(guān)鍵。5-氟尿嘧啶(5-FU)屬常用抗代謝藥物，可抑制SAP時(shí)的高炎性細(xì)胞因子血癥，通過(guò)抑制免疫過(guò)激的方式緩解SAP的病理生理學(xué)異常，達(dá)到治療的目的。但5-FU常規(guī)全身靜脈給藥具有一定的毒性[5]。本研究創(chuàng)建了SAP大鼠模型，重點(diǎn)分析了5-FU區(qū)域動(dòng)脈灌注對(duì)大鼠細(xì)胞凋亡的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般材料 2019年10月選取健康成年雄性SD大鼠(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)24只，體重252～305 g，平均(285.60±5.55)g。本研究已獲得本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.1.2儀器與試劑 儀器包括600E-2487系列高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)、Fresco 21超高速離心機(jī)(德國(guó)Thermo公司)、全自動(dòng)生化儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)、全自動(dòng)酶標(biāo)儀EL×800(廈門寶特科技有限公司)、顯微鏡[奧林巴斯(日本)有限公司]等。試劑包括5-FU注射液(上海旭東海普藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31020593)、5-FU標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司)、酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)、蘇木精-伊紅(HE)染色液(北京索萊寶科技有限公司)、原位末端標(biāo)記法凋亡檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)等。

1.2方法

1.2.1SAP模型創(chuàng)建與分組 24只大鼠均采用逆行胰膽管注射法創(chuàng)建SAP模型。術(shù)前禁食12 h，可自由飲水。給予10%水合氯醛3 mL/kg進(jìn)行麻醉。取上腹正中切口，自劍突下1.0 cm向下剪開(kāi)1.5～2.0 cm切口。經(jīng)腹白線剪開(kāi)肌肉，注意保護(hù)肝臟。以拉鉤打開(kāi)兩邊皮膚、肌肉，暴露內(nèi)臟。探查胰十二指腸，十二指腸翻開(kāi)拉向左側(cè)，暴露脂肪狀胰腺。肝臟內(nèi)稍傾斜乳白色管狀結(jié)構(gòu)即為胰膽管。逆行胰膽管，以5%牛磺膽酸鈉微泵泵入，創(chuàng)建SAP模型。術(shù)畢連續(xù)縫合皮膚、肌肉組織。術(shù)后常規(guī)保暖，禁食，不禁飲。編號(hào)后采用隨機(jī)數(shù)法抽樣分為A組、B組和C組，每組8只。A組創(chuàng)建SAP模型后不給予 5-FU；B組創(chuàng)建SAP模型后經(jīng)股靜脈輸注5-FU 10 mg/kg，采用0.1 mL肝素鈉生理鹽水封管，防止穿刺針內(nèi)殘留藥物；C組創(chuàng)建SAP模型后于10倍手術(shù)顯微鏡指導(dǎo)下區(qū)域動(dòng)脈灌注5-FU 10 mg/kg，主要自肝固有動(dòng)脈插管，直至胰十二指腸動(dòng)脈，經(jīng)導(dǎo)管給藥。術(shù)后縫合皮膚及皮下組織。

1.2.2血清淀粉酶、脂肪酶檢測(cè) 給藥后6 h股動(dòng)脈采血，取血清標(biāo)本，檢測(cè)血清淀粉酶、脂肪酶等。

1.2.3胰腺HE染色 采用頸椎脫臼法處死大鼠，開(kāi)腹取1.0 cm×1.0 cm胰腺組織，厚度盡量薄，以增大接觸面積。標(biāo)本固定于4%多聚甲醛中。用自來(lái)水洗滌10 min，脫水：75%乙醇持續(xù)1 h，85%乙醇持續(xù)1 h，95%乙醇持續(xù)1 h，95%乙醇持續(xù)1 h，無(wú)水乙醇持續(xù)30 min。透明：二甲苯Ⅰ持續(xù)30 min，二甲苯Ⅱ持續(xù)30 min，注意觀察組織形態(tài)。常規(guī)浸蠟，包埋，置于-20 ℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。蠟塊切片，厚度10 μm切齊整，4 μm細(xì)切。48 ℃撈片，置入68 ℃紅烤箱持續(xù)2 h。合理控制烤片時(shí)間，防止烤片過(guò)短引發(fā)脫片，烤片過(guò)久致使脫蠟時(shí)間延長(zhǎng)。常規(guī)脫蠟，蘇木精染色10 min，用自來(lái)水洗滌10 min。觀察充分返藍(lán)后伊紅染色25 s。中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察、拍片。采用原位末端標(biāo)記法檢測(cè)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡率，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核內(nèi)存在黃色顆粒。在光鏡下計(jì)算胰腺腺泡細(xì)胞凋亡指數(shù)，計(jì)數(shù)高倍鏡(400×)下500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞、總細(xì)胞數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4胰腺病理評(píng)分 取胰腺標(biāo)本，石蠟切片，HE染色，參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行胰腺病理評(píng)分，由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法評(píng)估，包括胰腺間質(zhì)水腫、腺泡細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、出血、脂肪壞死等，各項(xiàng)由輕至重以0～4分表示。

2 結(jié) 果

2.1胰腺組織光鏡觀察 3組大鼠胰腺腺體結(jié)構(gòu)均紊亂，部分腺泡組織空泡化，胰腺間質(zhì)水腫，存在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。C組大鼠胰腺炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、腺泡細(xì)胞空泡化、胰腺間質(zhì)水腫明顯較B組減輕。見(jiàn)圖1。

短箭頭：炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；長(zhǎng)箭頭：胰腺腺泡細(xì)胞空泡化。

2.23組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平比較 B、C組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平均明顯低于A組，且C組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平均明顯低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平比較

2.33組大鼠胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)、胰腺病理評(píng)分比較 B、C組大鼠胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)、胰腺病理評(píng)分均明顯低于A組，且C組大鼠胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)、胰腺病理評(píng)分均明顯低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)、胰腺病理評(píng)分比較

3 討 論

當(dāng)前，尚未具體明確急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制，考慮與腸道細(xì)菌易位、炎癥、胰腺腺泡內(nèi)鈣超載、細(xì)胞凋亡等因素有關(guān)[7]。有研究表明，SAP的發(fā)生、發(fā)展與炎癥應(yīng)激關(guān)聯(lián)較大。炎癥應(yīng)激還可造成患者自身組織、器官損傷，導(dǎo)致SAP患者出現(xiàn)免疫損傷，影響T淋巴細(xì)胞免疫功能。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，在急性胰腺炎發(fā)生、發(fā)展中，胰腺腺泡細(xì)胞凋亡發(fā)揮了重要作用[8-9]。目前，區(qū)域動(dòng)脈灌注作為SAP非手術(shù)治療手段已用于臨床，可經(jīng)由區(qū)域動(dòng)脈灌注給藥方式促使胰腺組織藥物濃度提升，增強(qiáng)療效[10]。但就SAP區(qū)域動(dòng)脈灌注藥物的選擇仍存在較大爭(zhēng)議，而灌注藥物組合方案選擇對(duì)療效具有直接影響。

有研究證實(shí)，5-FU可干擾DNA、RNA合成，控制胰腺腺泡細(xì)胞合成，抑制胰淀粉酶、胰蛋白酶的釋放，還具有控制某些炎癥介質(zhì)的作用，減輕炎性反應(yīng)[11]。李強(qiáng)等[12]研究表明，SAP大鼠經(jīng)5-FU區(qū)域動(dòng)脈灌注可減輕肺損傷，該作用機(jī)制與抑制促炎性細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)有關(guān)，但其未就胰腺細(xì)胞凋亡進(jìn)行深入分析。本研究中B、C組分別采用5-FU外周靜脈輸注、區(qū)域動(dòng)脈灌注途徑給藥，結(jié)果顯示，B、C組大鼠胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)、胰腺病理評(píng)分均較A組低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。分析與5-FU本身作用機(jī)制有關(guān)，其可被細(xì)胞攝取，并進(jìn)一步代謝成為幾種活性代謝產(chǎn)物，抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶活性，且能直接對(duì)DNA鏈延長(zhǎng)產(chǎn)生作用，促使DNA穩(wěn)定性出現(xiàn)變化，DNA斷裂，抑制細(xì)胞凋亡，達(dá)到減輕胰腺炎癥病理程度的目的。本研究結(jié)果還顯示，與B組比較，C組大鼠胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)、胰腺病理評(píng)分均更低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示5-FU區(qū)域動(dòng)脈灌注途徑給藥在抑制胰腺細(xì)胞凋亡、控制病情方面的價(jià)值較5-FU外周靜脈血管途徑給藥更佳。分析其原因，可能是因?yàn)?-FU區(qū)域動(dòng)脈灌注可提升胰腺組織內(nèi)5-FU藥物濃度，促使藥效的充分發(fā)揮，避免了出現(xiàn)外周靜脈途徑給藥所致5-FU較難進(jìn)入胰腺組織、全身體液免疫抑制等問(wèn)題。葉樂(lè)馳等[13]創(chuàng)建了SAP大鼠模型，并實(shí)施5-FU區(qū)域動(dòng)脈灌注，結(jié)果同樣證實(shí)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡被明顯抑制，認(rèn)為是改善急性胰腺炎的重要機(jī)制。此外，血清淀粉酶、脂肪酶與胰腺炎的發(fā)生關(guān)聯(lián)較大[14-16]。血清淀粉酶主要分泌自唾液腺、胰腺等，可分解多糖，其檢測(cè)指標(biāo)在急性胰腺炎的診療中判斷疾病嚴(yán)重程度方面發(fā)揮著重要作用。而脂肪酶為胰腺外分泌酶，正常時(shí)為消化酶的一種，進(jìn)入主胰管流入十二指腸參與消化，但胰腺細(xì)胞被免疫因子破壞崩解后便釋放入血，故血清脂肪酶水平取決于細(xì)胞崩解率，因此，檢測(cè)脂肪酶水平可判斷SAP患者的預(yù)后。本研究結(jié)果顯示，B、C組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平均明顯低于A組，且C組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平均明顯低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，SAP大鼠模型經(jīng)5-FU區(qū)域動(dòng)脈灌注可明顯抑制胰腺細(xì)胞凋亡，控制血清淀粉酶、脂肪酶水平，減輕病理改變程度，需引起高度關(guān)注。