董學(xué)妍,滕曉晶, 王智毅,王賢軍,余道軍

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院 檢驗科, 浙江 杭州 310006; 2.杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院 檢驗科, 浙江 杭州 310008)

胃癌的發(fā)病率位居惡性腫瘤第2位，嚴重影響著人類健康[1]。目前，胃癌的臨床治療仍以手術(shù)切除為主，同時輔以放療和化療。但放化療在殺傷腫瘤細胞的同時也常會對機體的免疫功能造成一定程度的損傷，免疫功能越低，患者的預(yù)后也越差[2-3]。諸多臨床實驗研究[4-6]顯示，中藥在治療腫瘤、減輕放化療毒副作用、增強患者免疫力等方面都發(fā)揮著巨大的作用。扶正康復(fù)合劑是浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院的臨床經(jīng)驗方，主要用于惡性腫瘤的中醫(yī)維持治療。扶正康復(fù)合劑的抗腫瘤作用機理尚未闡明，因而影響了其市場的拓展和應(yīng)用[7-8]。本研究以胃癌荷瘤裸鼠為模型，探討扶正康復(fù)方對胃癌腫瘤生長的抑制作用及其對細胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞 SPF級BALB/c雄性裸鼠購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(滬)2017-0005，使用許可證號：SYXK(浙)2018-0012。42只SPF級BALB/c雄性裸鼠4～5周齡，體質(zhì)量18～22 g，飼養(yǎng)于SPF級屏障環(huán)境中。胃癌SGC7901細胞株購于中科院上海富恒細胞庫。

1.2 實驗材料和試劑 扶正康復(fù)合劑由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院中藥房提供。每貼生藥用9倍質(zhì)量的水煎煮提取3次，每次1 h，最后成約180 mL藥液。順鉑注射液購于南京制藥有限公司(006013CF)，小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)、白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素6(IL-6)ELISA試劑盒購于上海信裕生物有限公司。

1.3 胃癌SGC7901移植性裸鼠建模和分組 BALB/c裸鼠適應(yīng)性生長3 d后，按裸鼠體質(zhì)量大小順序編號，采用隨機化工具將裸鼠分成6組，每組7只，分別為模型組、扶正低劑量組[12 g/(kg·d)]、扶正高劑量組[24 g/(kg·d)]、順鉑組[2 mg/(kg·d)]、聯(lián)合用藥低劑量組[順鉑2 mg/(kg·d)+扶正康復(fù)合劑12 g/(kg·d)]、聯(lián)合用藥高劑量組[順鉑2 mg/(kg·d)+扶正康復(fù)合劑24 g/(kg·d)]。將0.2 mL(含細胞數(shù)1×106個)胃癌SGC7901細胞株懸液注射入各組裸鼠左下肢外側(cè)皮下，待皮下腫瘤生長至1 cm×1 cm大小為胃癌SGC7901荷瘤裸鼠建模成功。

1.4 給藥方式 依照《中藥藥理實驗方法學(xué)》[9]的動物用藥劑量公式計算扶正低劑量組、扶正高劑量組的用藥劑量分別為12 g/(kg·d)和24 g/(kg·d)，給予7 d 0.4 mL/d灌胃。順鉑組給予0.2 mL/d腹腔注射，共注射7 d。模型組給予生理鹽水灌胃。

1.5 裸鼠體質(zhì)量、腫瘤組織質(zhì)量及抑瘤率計算 各組裸鼠于給藥7 d后采血并剝離腫瘤組織，稱體質(zhì)量和腫瘤組織質(zhì)量，計算抑瘤率。抑瘤率(%)=(對照組平均腫瘤組織質(zhì)量—實驗組平均腫瘤組織質(zhì)量)/對照組平均腫瘤組織質(zhì)量×100%。

1.6 TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-6水平檢測 對各組裸鼠進行眼球取血，1.5 mL全血經(jīng)3 600 r/min離心15 min，離心半徑為13.5 cm，取血清。采用雙抗體夾心ELISA法檢測各組裸鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6水平，實驗操作嚴格按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對腫瘤生長的影響 順鉑組、扶正高劑量組、聯(lián)合用藥低劑量組、聯(lián)合用藥高劑量組的腫瘤組織質(zhì)量均低于模型組，聯(lián)合用藥高劑量組的腫瘤組織質(zhì)量低于順鉑組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其抑瘤率為57.78%。見表1。

表1 各組裸鼠腫瘤生長情況

2.2 對TNF-α、IFNγ、IL-2、IL-6水平的影響 順鉑組裸鼠血清中免疫相關(guān)細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6水平均低于模型組，聯(lián)合用藥低劑量組和高劑量組裸鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6水平均高于順鉑組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組裸鼠血清TNF-α、IFNγ、IL-2、IL-6水平

3 討論

中醫(yī)藥治療可提高腫瘤患者免疫功能，改善臨床癥狀。胃癌主要表現(xiàn)為脾胃虧損，中醫(yī)對胃癌的治療遵循扶正培本的原則[10]。扶正康復(fù)合劑的主要成分為人參、石斛、茯苓、豬苓、白術(shù)、防風(fēng)、米仁、巴戟天、谷麥芽等15味中藥，具有大補元氣、滋養(yǎng)陰津、補脾益胃等功效，是浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院治療腫瘤的臨床經(jīng)驗方。順鉑在胃癌、睪丸癌、卵巢癌、子宮癌、膀胱癌、頸部癌、前列腺癌、腦癌等多種腫瘤的治療中表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢。但使用順鉑治療常會出現(xiàn)胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制現(xiàn)象、脫發(fā)、色素沉淀等不良反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥高劑量組的腫瘤組織質(zhì)量明顯低于順鉑組，抑瘤率為57.78%，提示扶正康復(fù)合劑聯(lián)合順鉑治療可抑制腫瘤生長，抑瘤效果優(yōu)于單獨使用順鉑。扶正康復(fù)合劑中人參的主要成分為人參皂苷，人參皂苷具有抑制腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用，人參皂苷Rh2的劑量與抑制胃癌SGC7901細胞增殖成正相關(guān)[11]；扶正康復(fù)合劑中的石斛可起到抗腫瘤、抗病毒、增強免疫調(diào)節(jié)等多種功能[12-13]。

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，機體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮著重要的免疫監(jiān)視作用。當(dāng)宿主免疫功能低下或受抑制時，腫瘤的發(fā)生明顯增加。同時，腫瘤的產(chǎn)生對機體免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生一定抑制作用。研究[14-15]表明，免疫細胞Th1/Th2失調(diào)是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因。Th1主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等細胞因子，參與細胞免疫和遲發(fā)性超敏性炎癥反應(yīng)；Th2主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等細胞因子，參與體液免疫應(yīng)答[16-17]。正常生理情況下，Th1和Th2處于動態(tài)平衡，維護機體正常的細胞免疫和體液免疫。當(dāng)腫瘤發(fā)生時，Th1和Th2功能發(fā)生紊亂[18]。本研究結(jié)果顯示，順鉑組裸鼠血清中免疫相關(guān)細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6水平均明顯低于模型組，表明順鉑可對機體免疫功能造成一定的損傷。同時，本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥低劑量組、聯(lián)合用藥高劑量組裸鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6水平均明顯高于順鉑組，表明扶正康復(fù)合劑可影響裸鼠分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6免疫相關(guān)細胞因子，具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用。有研究[19]顯示，人參多糖增強機體免疫水平的功效是通過提高IL-2、IL-8 和TNF-α水平實現(xiàn)的。另有報道[20]指出，茯苓能明顯抑制小鼠H22 實體瘤和肉瘤細胞的生長，提高T淋巴細胞的增殖能力，增加血清中TNF-α的含量，發(fā)揮機體的抗腫瘤能力和免疫調(diào)節(jié)作用。人參和茯苓是扶正康復(fù)合劑中的主要成分，扶正康復(fù)合劑增強機體免疫能力的功效可能與人參和茯苓有關(guān)。

綜上所述，扶正康復(fù)合劑能抑制胃癌SGC7901細胞荷瘤裸鼠腫瘤的生長，能促進裸鼠分泌免疫相關(guān)細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6。