張 強, 郭苗苗, 張 濤, 路宏朝, 王珊珊, 王 令

(陜西理工大學 生物科學與工程學院， 陜西 漢中723000)

維生素D (Vitamin D, VD) 是一種脂溶性類固醇激素，其與VD受體 (Vitamin D receptor, VDR)特異性結合形成VD/VDR復合體介導基因轉錄，調控細胞增殖、分化和凋亡等。大量研究表明VD的缺乏與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關，充足的VD可降低多種腫瘤的發(fā)生率，達到抗腫瘤的效果。microRNA是一類非編碼RNA，部分microRNA受VD/VDR復合物調控而發(fā)揮抗腫瘤作用，并成為腫瘤治療的新靶點。但是VD/VDR復合物如何介導microRNA的抗腫瘤分子機制仍未解析。

在癌癥治療過程中，CANARA等[1]研究發(fā)現活性維生素D(VD)的血清含量與患癌風險及癌癥治療有關。維生素D除維持血清中鈣、磷平衡穩(wěn)態(tài)、調節(jié)骨代謝等傳統(tǒng)功能外，近年來大量流行病學與臨床前研究表明維生素D的活性代謝產物——VD及其類似物在癌癥預防和治療中發(fā)揮重要作用，包括抑制炎癥，抑制癌細胞入侵和轉移，促進癌細胞凋亡與分化等[2]。micoRNA(miRNA)是一類非編碼小分子RNA，通過直接降解目標mRNA或抑制靶基因翻譯，降低靶基因表達水平。研究發(fā)現VD與維生素D受體結合形成復合物，調控特異microRNA的表達，從而發(fā)揮抗癌作用[3-4]。本文總結維生素D的作用通路以及通過調控microRNA表達水平而發(fā)揮的抗癌作用，以期為臨床診療及科學研究提供新思路。

1 維生素D代謝過程與作用通路

維生素D屬于脂溶性類固醇激素，通過與VDR結合調控靶基因的表達來發(fā)揮生物學功能。人體皮膚上皮細胞內的膽固醇經紫外線照射后氧化形成VD前體——7-脫氫膽固醇，運輸至肝臟經25-羥化酶催化形成25(OH)D3，25(OH)D3經血液運送至腎臟，在1-羥化酶作用下形成具有生物活性的VD——1,25(OH)2D3[5-8]。VDR基因位于人2號染色體長臂，基因長度為75 kb，含11個外顯子與10個內含子，屬于類固醇激素核受體超家族成員[9]。1,25(OH)2D3在VD轉運蛋白(VD binding protein, VDBP)作用下進入靶細胞，并與VDR結合后發(fā)揮其生物學作用 (圖1)。最初，VD與VDR結合，維甲酸X受體(RXR)介導自身與VD二聚化形成復合體，該復合體結合靶基因啟動子區(qū)域的VDR結合元件(VDRE)[10]，隨后聚集轉錄復合調節(jié)因子(Compound-mode, Co-mod)[11]，在RNA聚合酶Ⅱ的作用下，調節(jié)靶基因的轉錄，從而發(fā)揮相應生物學功能[12]。

圖1 VD調控靶基因表達示意圖

2 維生素D抗腫瘤的主要途徑

近20年的研究發(fā)現VD在幾種慢性非傳染性疾病，如心血管疾病、糖尿病或癌癥的發(fā)病、進展和預后具有保護作用。關于癌癥的發(fā)生，臨床前和流行病學證據都表明VD及VDR具有致癌保護作用[13]，VD及VDR介導的致癌保護或抑制腫瘤作用主要包括以下6個途徑。

2.1 介導細胞凋亡

1,25(OH)2D3通過誘導凋亡的內在機制來促進腫瘤細胞凋亡，尤其是通過抑制抗凋亡基因BCL2，激活促凋亡基因BAX的表達，以此激活細胞凋亡系統(tǒng)[14-15]。此外，已有研究發(fā)現在VDR敲除鼠的乳腺上皮細胞的凋亡延遲，而1,25(OH)2D3介導野生小鼠乳腺上皮細胞生理性凋亡[16]。

2.2 抑制細胞增殖

周期蛋白依賴性激酶 (CDK) 在調節(jié)細胞周期過程中發(fā)揮重要作用，因此CDK抑制子可作為潛在的腫瘤抑制劑[17-18]。1,25(OH)2D3促進CDK抑制子p21、p27表達上調，并降低CDK活性，因此可誘導成視網膜細胞瘤蛋白去磷酸化，最終導致腫瘤細胞停滯于G0/G1期。1,25(OH)2D3促進細胞生長因子結合蛋白3、表皮生長因子、細胞生長抑制子，如轉化生長因子-β的表達活性來抑制有絲分裂信號的傳導[19-20]，從而抑制細胞增殖。

2.3 抗炎癥

炎癥促進了許多腫瘤細胞的惡化，而1,25(OH)2D3在一些腫瘤細胞內顯示出良好的抗炎癥作用[21]。1,25(OH)2D3通過抑制環(huán)氧化酶2的表達來抑制前列腺素的合成，并增強15-羥基前列腺素脫氫酶的活性，降低前列素素受體的表達，從而抑制前列腺素作用通路，以此共同發(fā)揮抗炎癥作用[22-23]。此外，上調MAPK磷酸酶5的活性和下調促炎性因子的產生而抑制p38應激激酶的信號通路，從而發(fā)揮抗炎癥作用[24]。

2.4 抑制血管生成

1,25(OH)2D3通過抑制NF-kB信號通路內細胞白介素-8，低氧誘導因子1α的生成來抑制血管內皮生長因子的表達，從而共同抑制腫瘤環(huán)境內血管的生成[25-26]，發(fā)揮抗癌作用。在VDR敲除鼠中，缺乏1,25(OH)2D3可增強促血管生成因子的表達，如促凋亡因子(HIF1α)、血管生成素1和血小板轉化生長因子，表明這些促血管生成因子受控于VD/VDR復合物的調控[27]。此外，前列腺素E2可通過增強HIF1α的合成來促進血管的生成，1,25(OH)2D3可通過降低環(huán)氧化酶2的活性來減少前列腺素E2的產生，從而間接抑制血管生成[28-29]。

2.5 抑制腫瘤侵襲與轉移

惡性腫瘤細胞轉移是腫瘤病人死亡的主要原因之一[30]。血纖維蛋白溶酶原激活系統(tǒng)和基質金屬蛋白酶是腫瘤細胞轉移與入侵的重要激活因子[31]。已有研究表明1,25(OH)2D3可調控上述兩種激活子從而抑制腫瘤細胞的侵襲與轉移[32]。細胞粘合素C是一種細胞外基質蛋白，可增強腫瘤環(huán)境血管的生成并促進腫瘤細胞的侵襲，1,25(OH)2D3在轉錄水平通過下調細胞粘合素C而抑制腫瘤細胞的侵襲與轉移。基質金屬蛋白酶9結合細胞外基質發(fā)揮作用，以促進腫瘤細胞的入侵，1,25(OH)2D3通過抑制金屬蛋白酶9的活性，上調金屬蛋白酶1組織抑制劑的表達來抑制腫瘤細胞的侵襲與轉移[33-34]。E-鈣粘素是一種腫瘤抑制因子，與腫瘤的轉移呈負相關，1,25(OH)2D3可通過增強E-鈣粘素的表達來抑制腫瘤的轉移[35]。

2.6 促進細胞分化

1,25(OH)2D3處理部分腫瘤細胞后，其惡性程度下降并表現出其他正常且成熟的細胞表型，暗示1,25(OH)2D3具有促進腫瘤細胞分化成正常細胞的作用[36-37]。1,25(OH)2D3通過增強p21的表達而誘導人類骨髓白血病細胞終末分化成單核細胞或巨噬細胞[17]。在乳腺癌細胞中，1,25(OH)2D3介導酪蛋白、脂質和粘著蛋白的表達，從而提高腫瘤細胞分化水平，惡性程度下降，獲得更加成熟表型[25]。在前列腺癌細胞中，1,25(OH)2D3上調前列腺特異性抗原E-鈣粘素和骨形態(tài)生成蛋白6的表達增強前列腺癌細胞的分化水平，降低其惡性程度。此外，1,25(OH)2D3還可通過β-catenin信號通路，PI3K以及NF-kB信號通路調控細胞特異性分化[10]。

3 VD調控microRNA表達及其抑癌分子機制

microRNA是內源基因在復雜的多重控制下轉錄形成的一類功能非編碼RNA，能直接結合靶基因mRNA的3′或5′UTR區(qū)域，介導目標mRNA的降解或抑制翻譯，從而降低靶基因表達水平[38-39]。根據預測，microRNA調控哺乳動物約30%基因的表達水平。研究資料表明，細胞內microRNA異常表達而誘發(fā)癌癥的概率遠高于正常表達的組織。所以，揭示microRNA影響腫瘤發(fā)生的機制是腫瘤研究領域重要方向之一，其為診斷、治療和預防腫瘤提供新思路。

VD與受體VDR結合形成轉錄調控因子，作用于靶基因啟動子區(qū)的VDRE，從而調控目標microRNA的轉錄[40]。在多種腫瘤細胞中，VD在轉錄水平調節(jié)microRNA的表達，進一步通過microRNA調控相應靶基因表達，產生抑制癌細胞增殖或促進癌細胞凋亡等一系列致癌保護效應。表1展示了多種癌細胞中VD調控的microRNA及其靶基因表達水平。

表1 VD調控不同癌細胞microRNA表達水平

續(xù)表

3.1 卵巢癌

Kasiappan等[41]發(fā)現在人卵巢癌細胞OVCAR3中VD通過上調miR-498的表達來抑制人體端粒酶逆轉錄酶( hTRET )的表達，從而抑制癌細胞增殖。當用低濃度的VD處理OVCAR3 細胞24小時，miR-498首先產生應答，表明miR-498是對VD敏感的早期基因，且隨著VD濃度的升高，miR-498表達水平呈濃度依賴性上調。進一步應用染色體免疫共沉淀實驗發(fā)現，VDR-RXR異源二聚體結合于miR-498基因上游調控區(qū)的VDRE序，并募集共激活因子，增強miR-498表達水平。隨后miR-498靶向結合hTRET 的mRNA 3′UTR，降解其mRNA。所以，在卵巢癌細胞中VD的抗癌作用主要通過上調miR-498表達，特異性降低hTRET表達水平，從而抑制癌細胞增殖。而且，miR-498介導的hTERT表達下調是降鈣三醇在女性雌激素敏感腫瘤中抗瘦素活性的關鍵。

3.2 宮頸癌

González-Duarte 等[42]利用VD分別處理宮頸癌細胞SiHa，Hela和c33A ,24小時和48小時后，SiHa細胞內Dicer的表達水平在兩個時間點都發(fā)生上調；在Hela細胞中，僅在藥物作用48小時后 Dicer的表達水平增加，而在VDR表達陰性的c33A細胞，未發(fā)現Dicer 基因表達變化。此外，VD處理后SiHa細胞有大量microRNA上調，且miR-22, miR-2963p, miR-29c, miR-342-5p, miR-4455, miR-4462和miR-4656在兩個時間段都發(fā)生了上調。隨后利用凝膠電泳遷移實驗與矩陣模型分析證明在Dicer基因啟動子區(qū)有VDRE存在。綜上，VD/VDR共同作用于Dicer酶基因啟動子區(qū)的VDRE，促進酶的表達從而加速microRNA的加工過程，進而調控microRNA靶基因的表達水平，從而發(fā)揮抗癌作用。

3.3 前列腺癌

Ting等[43]發(fā)現在人類前列腺癌細胞LNCaP內，miR-98呈VDR依賴性表達。miR-98通過下調細胞周期素J (cyclin J, CCNJ )的表達,使細胞周期停滯于G2/M期而發(fā)揮抗癌作用。染色質免疫共沉淀結果顯示，VD/VDR復合物募集共激活因子結合于microRNA-98編碼基因HUWE1的VDRE，促進miR-98的表達上調。此外，VD通過抑制microRNA加工蛋白LIN28的表達來間接調控miR-98上調。最后利用熒光素酶報告系統(tǒng)證實miR-98作用于CCNJ mRNA的3′UTR區(qū)，降解其mRNA而降低表達水平。綜上，在前列腺癌細胞程中，VD 通過直接和間接方式促進miR-98的表達上調，抑制CCNJ活性，使細胞停滯于G2/M期從而抑制癌細胞增殖。

Thorne等[44]發(fā)現用100 nmol/L VD 處理人類前列腺癌細胞P69SV40T 24小時后，發(fā)現細胞生長周期阻滯于S期。研究在微小染色體維持蛋白(MCM7)啟動子區(qū)存在VDRE，隨后VD通過結合VDR共同作用于VDRE從而上調 MCM7基因的表達，而miR-106位于MCM7基因內含子中，故VD通過上調MCM7從而促進miR-106的表達。隨后發(fā)現細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21是miR-106的靶基因，miR-106可特異性降解p21,從而阻礙細胞生長。綜上，在P69SV40T細胞中，VD 通過與VDR結合后共同作用于MCM7基因啟動子區(qū)VDRE,從而上調MCM7基因的表達，以此促進miR-106的表達，抑制其靶基因p21，從而發(fā)揮抑制癌細胞增值的功能。

3.4 胃癌

Chang等[45]發(fā)現在胃癌細胞SGC-7901、AGS中，VD通過上調miR-145的表達抑制轉錄調節(jié)因子E2F3和細胞周期素依賴性激酶6的表達使細胞周期停滯于S/G2期，進而抑制細胞增殖。染色質免疫共沉淀實驗證實VD與VDR作用后結合在miR-145基因上游調節(jié)區(qū)的VDRE, 并募集共激活因子，增強miR-145表達水平，呈現VD/VDR計量依賴性上調。隨后進一步通過熒光素酶實驗證實miR-145作用于E2F3和CDK6的mRNA 3′UTR，降解其mRNA而降低表達水平。此外，與正常胃細胞相比，胃癌細胞內miR-145表達水平較低，表明miR-145是一種潛在的胃癌抑制子。綜上，在胃癌細胞中，VD的抗癌作用主要是通過上調miR-145的表達，特異性降低E2F3和CDK6表達水平，從而抑制癌細胞增殖。

3.5 乳腺癌

乳腺癌作為腫瘤中控制水平最高的癌癥之一，其發(fā)生與發(fā)展符合慢性疾病特征。在其發(fā)生過程中，腫瘤易感的乳腺細胞，通過特殊的表觀遺傳學通路，引發(fā)腫瘤祖細胞的形成，成為乳腺癌發(fā)生的始動因素，該過程不僅涉及眾多原癌基因和抑制基因，還涉及腫瘤微環(huán)境microRNA的改變。RORIO率先發(fā)現miR125-b是浸潤性乳腺癌細胞中常見的表達失調microRNA之一[46]，其在人與線蟲細胞中均有表達，且高度保守。研究表明miR125-b存在兩個前體miR125-b-1和miR125-b-2，分別由染色體11q24.1和21q21.1轉錄而來。乳腺癌中VDR高表達亦可改善預后甚至降低死亡風險。但此觀點存在爭議，有學者發(fā)現VDR在一些腫瘤細胞內亦高表達，并認為VDR高表達是促進癌細胞增殖的因素之一。有文獻報道在乳腺癌或者甲狀腺癌中VDR表達水平呈上升趨勢。在乳腺癌細胞MCF-7中，miR125-b表達下調并靶向調節(jié)的VDR表達水平上升[47]，以此誘導癌細胞的發(fā)生與發(fā)展。這種矛盾的結果可能與腫瘤類型和microRNA靶點復雜多變有關，從而雙向調控腫瘤細胞增殖，最終發(fā)揮何種作用取決于綜合效應，而腫瘤類型與細胞表型決定了凈效應的產生。事實上，miR-125b的表達與人類乳腺癌細胞MCF-7關系并未完全闡明清晰，需進一步細致深入研究。

此外Min等[48]研究發(fā)現，在乳腺癌細胞MCF-7與MDA-MB-231中，VD可增強癌細胞對自然殺傷細胞的敏感性，從而發(fā)揮抑制癌細胞增殖的功能。NKG2D是免疫系統(tǒng)中重要的激活性受體，它通過識別靶細胞表面誘導產生的配體來傳遞活化信號并激活免疫系統(tǒng)，從而對靶細胞發(fā)揮殺傷作用。研究發(fā)現在乳腺癌細胞表面存在NKG2D的配體MICA/B與ULBPs。利用microRNA測序發(fā)現，MCF-7與MDA-MB-231經VD處理后，miR-302c和miR-520c顯著下調，雙熒光素酶實驗發(fā)現miR-302c與miR-520c通過與MICA/B和 ULBP2的mRNA3′UTR端結合從而負向調控基因表達。隨后超表達MICA/B和ULBP2基因后，自然殺傷細胞對MCF-7與MDA-MB-231的殺傷作用顯著增強。綜上, VD 通過抑制miR-302c和miR-520c的表達而正向調控MICA/B、ULBPs，激活腫瘤細胞對自然殺傷細胞的敏感性，以此發(fā)揮抗腫瘤作用。

3.6 肺癌

has-let-7a microRNA是一種腫瘤抑制子，通過靶向抑制胰島素受體底物1(IRS1)，BCL2及致癌基因RAS的表達，發(fā)揮抗腫瘤細胞增殖的功能[49]。在人類肺癌細胞A549中，VD通過增強has-let-7a的表達而抑制細胞增殖。熒光素酶報告系統(tǒng)和染色質免疫共沉淀實驗結果證明，VD與VDR復合物結合于let-7a-2基因上游調節(jié)區(qū)的VDRE，促進let-7a-2的表達。綜上，VD /VDR直接作用let-7a-2基因啟動子，正向調控let-7a-2表達，隨后靶向抑制IRS1、BCL2和RAS基因的表達從而抑制腫瘤細胞增值。

3.7 結直腸癌

流行病學顯示人體內低水平VD可能提高患癌癥的風險，臨床研究已證實VD的抗癌作用可應用于多種癌癥[10]。對于人類結腸癌，臨床研究證實血清中VD濃度大于82 ng/mL可降低50%患癌風險。Padi等[50]用VD處理結直腸癌細胞 (HT-29、HCT-116) 24小時后miR-627表達水平顯著上升。miR-627位于人類第15號染色體，VDR-RXR二聚體與VD結合形成復合物共同作用于miR-627啟動子區(qū)域，調節(jié)miR-627的表達上調，miR-627靶向抑制組蛋白去甲基化酶JMJD1A活性[51]。所以，在結直腸癌細胞中VD的抗癌作用主要通過上調miR-627，抑制JMJD1A活性相關信號通路實現。

3.8 白血病

Wang等[52]發(fā)現，VD介導的microRNA表達可阻止白血病細胞增殖。用VD處理HL-60，NB4和U937細胞，miR-26a表達上調，C-myc基因表達下調，從而抑制細胞增值。低濃度VD處理早幼粒白血病細胞HL-60和U937后，miR-181a表達水平顯著下降，P27表達水平上調，使細胞周期停滯于G1/S期[53-54]。此外，miR-26a也可直接靶向E2F7轉錄抑制子，促進P27蛋白表達上調，導致細胞停滯于G1/S期。因此， VD通過下調miR-181a或上調miR-26a表達抑制腫瘤細胞增殖。

此外Gocek等[55]用VD處理HL-60和U937后發(fā)現miR-32表達上調，促凋亡基因BIM在轉錄水平受到抑制。干擾Drosha和Dicer基因后，VD誘導的miR-32表達上調消失，而超表達miR-32可導致BIM基因表達下調，細胞存活數目顯著增多，BIM可能是miR-32的靶基因。因此，miR-32作為治療人類骨髓樣白血病的潛在靶基因，開發(fā)靶向抑制miR-32的藥物為白血病治療提供新方案。

Min等[48]研究表明VD處理人類急性白血病細胞 (Kasumi) 和K-562細胞24小時后，可增強該細胞對自然殺傷細胞(NK92)的敏感性。不同濃度VD處理細胞后，miR-302C和miR-520c在Kasumi和NK92中表達下調，進一步研究表明miR-302C和miR-520c通過直接靶向結合并降解MICA、MICB和ULBP2 mRNA3′UTR，負向調節(jié)NKG2D配體通路。所以，在白血病細胞Kasumi和K-562中，VD通過下調miR-302C和miR-520c，特異性降低MICA、MICB和ULBP2表達水平，從而實現抑制腫瘤細胞增殖的目的。

4 結語與展望

研究表明活性VD及其受體VDR在抗癌過程中發(fā)揮越來越重要的作用，因此進一步深入理解VD/VDR的抗癌作用機制，解析VD與腫瘤發(fā)生的關系對腫瘤預防與治療至關重要[10,56]?；钚訴D在不同類型腫瘤細胞中通過調節(jié)microRNA表達而發(fā)揮抗癌作用，同時microRNA亦可調控VD及其受體的信號通路，表現出特異生物學現象。若使用活性VD 作為治療腫瘤的藥物，其潛在問題是無法準確控制發(fā)揮理想生物學效應的劑量，以及可能出現的毒副作用。因此，現階段研究結果表明，利用VD作為抗癌藥物還為時尚早。在細胞水平的研究中，很容易控制VD的攝入量，易于檢測特殊microRNA表達水平的改變。然而，在人體中并非如此，因為不同飲食成分會發(fā)生協(xié)同或對立的作用，這增大了研究VD在人體作用機制的難度。因此，應該深入了解活性VD介導microRNA調控癌細胞增殖或侵襲的分子機制，為后續(xù)開發(fā)VD及其衍生物作為新型抗癌藥物提供理論支撐。