蘇鵬超， 藺蓓蓓， 陳 琛,2*

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000; 2.陜西理工大學(xué) 中德天然產(chǎn)物研究所/陜西省天麻山茱萸工程技術(shù)研究中心， 陜西 漢中 723000)

中藥山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc)為山茱萸科山茱萸屬植物山茱萸干燥成熟果肉，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為我國傳統(tǒng)珍貴的中藥材，又名山萸肉、石棗、蜀棗、棗皮等[1]。山茱萸主要分布于河南、陜西、浙江、安徽、山西等省份，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)[2]。山茱萸含有糖苷類及苷元、鞣質(zhì)類、有機(jī)酸及其酯類、揮發(fā)油、五環(huán)三萜及其酯類、環(huán)烯醚萜苷、微量元素等，富含不飽和脂肪酸，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，是很好的亞油酸來源[3-7]。其中，環(huán)烯醚萜苷類成分具有消炎、防衰老、抗氧化、降血糖、調(diào)節(jié)免疫活性、抗癌等作用[8-11]，主要活性成分包括莫諾苷、當(dāng)藥苷、馬錢苷、山茱萸新苷等十余種。此外，五環(huán)三萜類成分具有降血糖、調(diào)血脂作用[12-15]，具有保肝、抗病毒、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激等功效，主要活性成分有齊墩果酸和熊果酸[16-19]。

關(guān)于山茱萸含量的測定已取得了一些成果，如唐凱等[20]測定了山茱萸果核中4種成分的含量，劉云[21]對(duì)山茱萸炮制前后4種成分的含量變化作了對(duì)比等。目前，山茱萸的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制標(biāo)準(zhǔn)仍然不夠全面，本研究建立了同時(shí)測定莫諾苷、當(dāng)藥苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸6種成分的分離分析方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)山茱萸藥材中多種成分含量的同步測定，為使山茱萸藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)更全面、合理。

1 材料與儀器

1.1 藥材

山茱萸果實(shí)分別采自河南省西峽縣、浙江省淳安縣、陜西省佛坪縣，經(jīng)陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院王勇博士鑒定，確定為山茱萸屬山茱萸果實(shí)，洗凈去核后烘干備用。

1.2 試劑

莫諾苷(批號(hào)25406-64-8)、當(dāng)藥苷(14215-86-2)、馬錢苷(批號(hào)18524-94-2)、齊墩果酸(批號(hào)508-02-1)、熊果酸(批號(hào)77-52-1)購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司；山茱萸新苷(批號(hào)131189-57-6)購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；UPLC-DAD(面積歸一化法)檢測標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98%；甲醇(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)、乙腈(Sigma公司)和體積分?jǐn)?shù)85%磷酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠)均為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 儀器

Ultimate 3000超高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)，ME104E /02型分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，KQ5200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，RE-3000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，UPH-11-20T超純水機(jī)(ULUPURE公司)，島津Inertsil ODS-3 C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，4 μm)，中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液及混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品莫諾苷10.0 mg、當(dāng)藥苷10.0 mg、馬錢苷11.9 mg、山茱萸新苷5.2 mg、齊墩果酸9.8 mg、熊果酸13.0 mg，用甲醇分別多次溶解定容至6個(gè)10 mL容量瓶中，得對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度分別為1.00、1.00、1.19、0.52、0.98、1.30 mg/mL的儲(chǔ)備液。分別取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至10 mL。混合對(duì)照品溶液濃度分別為：莫諾苷0.050 mg/mL、當(dāng)藥苷0.050 mg/mL、馬錢苷0.073 mg/mL、山茱萸新苷0.016 mg/mL、齊墩果酸0.039 mg/mL、熊果酸0.091 mg/mL。

2.2 供試品溶液的制備

取3種產(chǎn)地山茱萸果實(shí)適量，粉碎機(jī)粉碎，精密稱定粉末(過80目篩)各4 g，置500 mL平底燒瓶中，以1∶10料液比加入體積分?jǐn)?shù)90%乙醇，70 ℃下熱回流提取90 min，重復(fù)提取兩次，過濾合并兩次濾液，減壓濃縮至干，色譜級(jí)甲醇溶解定容至10 mL容量瓶得山茱萸乙醇提取物供試液。

精密稱定3種產(chǎn)地山茱萸果實(shí)粉末(過80目篩)各4 g，置500 mL平底燒瓶中，以1∶10料液比加入去離子水，70 ℃下熱回流提取120 min，重復(fù)提取兩次，過濾合并兩次濾液，減壓濃縮至干，超純水溶解定容至10 mL容量瓶得山茱萸水提取物供試液。

2.3 色譜條件

UPLC分析在Thermo UltiMate 3000 UPLC系統(tǒng)上進(jìn)行，該系統(tǒng)由四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、樣品盤和UV檢測器組成。分析柱是島津Inertsil ODS-3 C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，4 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)和0.2%磷酸(B)，檢測波長為210、218、240 nm，進(jìn)樣量為10 μL，流速為1 mL/min，檢測溫度為30 ℃。梯度洗脫條件：0～10 min，10%～20%A；10～20 min，20%～40%A；20～35 min，40%～60%A；35～55 min，60%～80%A；55～60 min，80%A。每個(gè)樣品平行3次?；旌蠈?duì)照品色譜圖見圖1，佛坪山茱萸乙醇提取物色譜圖見圖2。

注：1-莫諾苷;2-當(dāng)藥苷;3-馬錢苷;4-山茱萸新苷;5-齊墩果酸;6-熊果酸圖1 混合對(duì)照品的UPLC色譜圖(210 nm)

(a) 240 nm(1-莫諾苷，2-當(dāng)藥苷， 3-馬錢苷)

(b) 218 nm(1-山茱萸新苷)

(c) 210 nm(1-齊墩果酸，2-熊果酸)圖2 佛坪山茱萸果實(shí)乙醇提取物的UPLC色譜圖

2.4 系統(tǒng)適用性

精密吸取2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖。莫諾苷、當(dāng)藥苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸、熊果酸6個(gè)化學(xué)成分的保留時(shí)間分別為6.043、8.467、8.943、15.727、54.537、55.487 min?；旌蠈?duì)照品所測的6種成分與相鄰色譜峰的分離度較好，系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)符合含量測定要求。

2.5 線性關(guān)系考察

按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，調(diào)整2.1項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液的進(jìn)樣量為3、6、9、12、15 μL(n=3)，以各對(duì)照品質(zhì)量濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，各成分回歸方程和線性范圍見表1。結(jié)果表明，6種成分在測定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各被測成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

2.6 儀器精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，按2.3項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得出莫諾苷、當(dāng)藥苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD(n=6)分別為0.08%、0.13%、0.24%、0.11%、0.15%、0.74%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性考察

取佛坪山茱萸果實(shí)粉末6份，每份4 g，按2.2項(xiàng)下方法制備乙醇提取液，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算含量。莫諾苷、當(dāng)藥苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸、熊果酸含量(n=6)分別為5.22、3.83、0.73、1.03、0.58、0.25 mg/g，其RSD分別為0.50%、0.46%、1.26%、0.42%、0.78%、1.92%，表明重復(fù)性良好。

2.8 供試品溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份供試品溶液(佛坪山茱萸果實(shí)乙醇提取物供試液)，在溶液配置后的0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，計(jì)算得出莫諾苷、當(dāng)藥苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD(n=6)分別為0.73 %、0.42 %、1.34 %、0.36 %、0.71%、1.50%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 樣品含量測定

分別取不同產(chǎn)地山茱萸果實(shí)，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，外標(biāo)法計(jì)算樣品含量,結(jié)果見表2。

表2 山茱萸果實(shí)中6種成分含量測定結(jié)果 mg/g(n=3)

P<0.05。

3 討論與結(jié)論

3.1 樣品提取方法的選擇

水提、醇提為提取常用方法，且兩種溶液極性差異大。本研究參考劉艷妮[4]、張永生[21]的實(shí)驗(yàn)，最終確定為1∶10的料液比，采用體積分?jǐn)?shù)90%乙醇，70 ℃下熱回流提取90 min制備山茱萸果實(shí)乙醇提取物；確定1∶10的料液比，采用去離子水，70 ℃下熱回流提取120 min制備山茱萸果實(shí)水提取物的提取方法。

3.2 色譜條件的考察

參考劉艷妮[4]的研究，采用全波長進(jìn)行掃描，確定了3個(gè)環(huán)烯醚萜苷類化合物的最大吸收波長為240 nm，另一個(gè)環(huán)烯醚萜苷類化合物山茱萸新苷的最大吸收波長為218 nm，兩種五環(huán)三萜類化合物的最大吸收峰為210 nm。在流動(dòng)相體系選擇中，對(duì)比了甲醇-水、乙腈-體積分?jǐn)?shù)0.1%磷酸水溶液、乙腈-體積分?jǐn)?shù)0.2%磷酸水溶液體系，結(jié)果表明，只有用乙腈-體積分?jǐn)?shù)0.2%磷酸水溶液系統(tǒng)時(shí)才能使3個(gè)環(huán)烯醚萜類成分分離完全，且基線平穩(wěn)，因此采用該流動(dòng)相對(duì)供試樣品進(jìn)行梯度洗脫。

3.3 含量測定結(jié)果分析

3個(gè)產(chǎn)地的山茱萸果實(shí)乙醇提取物均可檢出6種成分，由于生長環(huán)境不同，其成分含量有所差異。6種成分含量由高到低排布序列為莫諾苷>當(dāng)藥苷>山茱萸新苷>馬錢苷>齊墩果酸>熊果酸；3個(gè)產(chǎn)地的山茱萸果實(shí)水提取物均可檢出4種成分，齊墩果酸與熊果酸未檢測出，初步判定該兩類成分不溶于水或者水提取率低，與前人研究相符[22]。產(chǎn)自陜西佛坪的山茱萸果實(shí)乙醇提取物中6種成分含量最均衡，河南西峽的山茱萸果實(shí)水提取物中莫諾苷含量最多，含量為(6.40±0.064) mg/g，浙江淳安的山茱萸果實(shí)乙醇提取物中馬錢苷和齊墩果酸含量最多，含量分別為(0.89±0.030)、(0.62±0.010) mg/g。

3.4 小結(jié)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，3個(gè)產(chǎn)地山茱萸、兩種不同提取方法所測定得出的藥性成分種類及含量有一定差異，其原因是否與山茱萸果實(shí)處理方法及采收時(shí)間等因素有關(guān)，還需采集更多樣品進(jìn)行比較研究。本研究所建立的同時(shí)測定山茱萸中6種成分的UPLC方法簡單、經(jīng)濟(jì)、重現(xiàn)性好，可用于山茱萸藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。