李杰，吳艷芳，王新勝，趙明明，王藝文

(1.河南科技大學 醫(yī)學院，河南 洛陽 471023;2.河南科技大學 化工與制藥學院，河南 洛陽 471023)

枳實中的標志性黃酮類成分柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷，由于具有抗氧化、降血脂、增強免疫力等生物活性[1]，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工和保健品領(lǐng)域。目前針對枳實中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的提取多采用水[2]和有機溶劑[3-6]，提取效率低、能耗高且污染環(huán)境。因此，有必要開發(fā)一種綠色高效的新型溶劑來提取枳實中的柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷。低共熔溶劑(DESs)，也被稱為“類離子液體”，具有和離子液體類似的物理化學性質(zhì)，但又避免了其制備繁瑣、價格昂貴、難生物降解等不足。因此，本研究以DESs為溶劑，采用單因素和響應(yīng)面法對超聲輔助提取工藝進行了優(yōu)化，以期為枳實的深度開發(fā)提供參考。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

枳實，洛陽同仁堂藥店；柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷標準品，國家標準物質(zhì)中心；乙腈、磷酸為色譜純；乙醇、乙二醇、氯化膽堿均為分析純。

天美LC2000液相色譜儀；BT125D雙量程電子分析天平；KQ2200DE超聲波清洗儀；CT14RD高速離心機。

1.2 實驗方法

1.2.1 DESs的合成 將氯化膽堿和乙二醇按照1∶1的摩爾比混合于燒杯中，70 ℃水浴加熱攪拌1 h，得到無色、透明的DESs溶液。臨用前將DESs與水(V/V=4∶1)混合，即得DESs提取溶劑。

1.2.2 供試液的制備 稱取2.0 g枳實粉末與DESs提取溶劑混合，按照一定的液料比30∶1(mL/g)、超聲功率150 W和超聲時間15 min進行提取。每組實驗平行進行3次，取平均值。提取結(jié)束后，移取提取液2.0 mL，在10 000 r/min的條件下離心3 min，取上清液1 mL于100 mL的容量瓶中，50%甲醇溶液(V/V)定容，搖勻后過0.45 μm濾膜，得供試液。高效液相色譜法檢測。

1.3 黃酮含量的測定

1.3.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18柱子(250×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水-磷酸(20∶80∶0.020,v/v)；流速為1 mL/min；檢測波長為283 nm；進樣量為20 μL；柱溫為室溫。

1.3.2 標準曲線繪制 精密稱取柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的標準品20 mg，50%甲醇溶液溶解，然后轉(zhuǎn)移至200 mL的容量瓶中，50%甲醇溶液定容，得標準品儲備液。將儲備液逐級稀釋為5，10，15，20，25 μg/mL的混合標準品溶液。搖勻后過0.45 μm濾膜，高效液相色譜法檢測。以混合對照品質(zhì)量濃度為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線，線性回歸，得到3種黃酮類成分的回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Table 1 Results of linear correlation test

1.3.3 黃酮總提取率的計算 枳實中3種黃酮類成分總提取率按下式計算：

Y/%=(C1+C2+C3)×V×N/(104×M)

式中Y——3種黃酮的總提取率；

C1、C2、C3——分別為標準曲線得出的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量,μg/mL；

V——提取溶劑體積,mL；

N——稀釋倍數(shù)；

M——枳實質(zhì)量,g。

2 結(jié)果與討論

2.1 對照品與供試液的HPLC色譜圖

由圖1可知，提取物中柚皮苷、橙皮苷以及新橙皮苷與對照品具有相同的保留時間，并且3種黃酮類物質(zhì)分離完全，雜質(zhì)峰無干擾，可用于提取物中3種黃酮類成分含量的測定。

圖1 供試液(a)和混合標準品(b)高效液相色譜圖Fig.1 The HPLC of sample(a) and(b) mixed reference substance1.柚皮苷；2.橙皮苷；3.新橙皮苷

2.2 單因素實驗

2.2.1 液料比對3種黃酮總提取率的影響 由圖2可知，隨著液料比的增大黃酮總提取率逐漸升高。這可能是由于液料比的增大，提高了提取溶劑與藥物的接觸面積，加大了固液間黃酮類成分的溶度差，使黃酮的傳質(zhì)動力增加，因此使得藥物中更多的目標組分溶入提取溶劑中[7]；但液料比過大，超聲波能量的傳導受到阻礙，導致枳實細胞壁的破碎程度減弱，不利于黃酮類成分的溶出，致使黃酮總提取率下降[8]。因此，選擇液料比30∶1 mL/g較為適宜。

圖2 液料比對總提取率的影響Fig.2 Effect of solvent ratio on the yield of flavonoids

2.2.2 超聲功率對3種黃酮總提取率的影響 由圖3可知，隨著超聲功率的增大，黃酮總提取率先升高后降低。植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成，超聲波可有效的降低纖維素的結(jié)晶度和聚合度，水解半纖維素[9]，DESs對木質(zhì)素有良好的溶解性[10]。因此，在相同的提取時間內(nèi)，超聲功率越大，細胞壁的破碎程度就越大，黃酮總提取率就越高。但超聲功率過大，強烈超聲波作用會導致已溶出的黃酮類成分發(fā)生降解[11]。因此，選擇超聲功率125 W較為適宜。

圖3 超聲功率對總提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasound power on the yield of flavonoids

2.2.3 超聲時間對3種黃酮總提取率的影響 超聲功率為125 W，由圖4可知，隨著超聲時間的延長，黃酮總提取率先升高后降低。這可能是由于隨著超聲時間的延長，超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)使枳實細胞壁的破碎程度趨于完全[12]，利于細胞內(nèi)的黃酮類成分溶出，但長時間超聲破壞了已溶出黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)[13]，使得黃酮提取率降低。因此，超聲時間選擇10 min較為適宜。

圖4 超聲時間對總提取率的影響Fig.4 Effiect of ultrasound time on the yield of flavonoids

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件

以液料比、超聲功率和超聲時間為實驗因子，3種黃酮總提取率為響應(yīng)值，運用Design-Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Behnken模式，設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面實驗，優(yōu)化提取工藝。分析因素和水平設(shè)計見表2,結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken實驗因素與水平Table 2 Factors and levels used in Box-Behnken design

根據(jù)表3的實驗結(jié)果，用Design-Expert 8.0.6.1軟件擬合，得到總提取率(Y)對各因素的回歸方程Y(%)=-11.79+0.28A+0.98B+0.087C-1.3×10-3AB+7.3×10-3AC-0.010BC-1.31×10-3A2-0.011B2-0.033C2，表4為方差分析結(jié)果。

表3 Box-Behnken實驗結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental results

表4 方差分析 Table 4 Analysis of variance for the fitting regression model

由表4可知，該數(shù)學模型F=64.13，P<0.000 1，表明具有極顯著性；由失擬項F=1.23，P=0.407 2>0.05，差異不顯著，可知模型的擬合良好，實驗誤差小。模型復合相關(guān)系數(shù)和校正決定系數(shù)分別為R2=0.988 0和AdjR2=0.972 6，說明此模型的實驗值與預測值接近，可用此模型和方程來推測實驗結(jié)果[14]。模型響應(yīng)值與超聲功率、液料比、超聲時間高度相關(guān)，其中超聲功率和液料比達到極顯著水平(P<0.01)；超聲時間達到顯著水平(P<0.05)。超聲功率與超聲時間交互項、液料比次項以及超聲時間二次項均達到極顯著水平(P<0.001)，說明各因素對響應(yīng)值的影響較復雜，不是簡單的線性關(guān)系。F值可判斷各因素對黃酮總提取率影響的強弱，其值越大，影響越大。由此可知，各個因素對響應(yīng)值的影響強弱為A(超聲功率)>B(液料比)>C(超聲時間)。

圖5分別表示超聲時間、液料比以及超聲功率取零水平時，其余兩個因素對黃酮總提取率的影響的響應(yīng)面圖。

圖5 兩兩因素交互作用對3種黃酮總提取率的影響Fig.5 Response surface plots of operating parameters on the extraction rate of flavonoids

由圖5可知，響應(yīng)值隨3個因素的增大先升高后降低，說明最佳提取條件在所選的實驗范圍內(nèi)。通過 Design Expert 8.0.6.1軟件分析，可知提取條件的最佳為超聲功率118.52 W，液料比31.62∶1 mL/g，超聲時間9.55 min，理論提取率為20.91%。響應(yīng)面在底面的投影為等高線圖，橢圓形表示顯著，而圓形表示不顯著。由圖5可知，超聲功率與超聲時間交互作用的等高線最為扁平，因此二者交互作用最為顯著；其次為液料比與超聲時間；超聲功率與液料比的交互作用最小，與方差分析結(jié)果一致。

2.4 驗證實驗與對比實驗

為了方便操作，將最佳提取條件修正為超聲功率125 W，液料比32∶1 mL/g，超聲時間為9 min，在此條件下進行3組平行實驗，實測黃酮總提取率分別為20.82%,20.63%,20.90%，平均提取率為20.78%，與理論值20.91%的相對誤差為0.62%，說明采用Box-Behnken響應(yīng)面法得到的最優(yōu)工藝參數(shù)穩(wěn)定、可靠。 將該提取方法與超聲法[15]和乙醇回流法[4]進行了對比，結(jié)果見表5。

表5 對比實驗Table 5 Contrast experiment

由表5可知，超聲輔助低共熔溶劑法，具有時間短、提取率高的優(yōu)點。

3 結(jié)論

以氯化膽堿、乙二醇和水組成的DESs為提取溶劑，采用超聲輔助法提取枳實中的柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷，并應(yīng)用Box-behnken響應(yīng)面法對該提取工藝進行優(yōu)化,確立了枳實中3種黃酮類成分提取的最佳條件，即超聲功率125 W，液料比32∶1 mL/g，超聲時間9 min。在該條件下,3種黃酮的總提取率為20.78%，與模型的理論值20.91%相近。