王晨杰，薛源，張鑫，于萍，羅運柏

(1.武漢大學(xué) 化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院 有機硅化合物與材料教育部工程研究中心，湖北 武漢 430072；2.解放軍第960醫(yī)院,山東 濟南 250031；3.中天恒安(北京)科技有限公司，北京 100000)

次氯酸鈉是一種能以任意比例與水互溶的含氯消毒劑，溶于水中可生成新生態(tài)氧和次氯酸，HClO的強氧化性是NaClO溶液能夠高效殺菌的主要因素[1-2]。研究表明，HClO的濃度與溶液的pH值密切相關(guān)[3-4]，當pH值在5～7的范圍內(nèi)時，HClO的含量達90%以上[5-7]。一般稀釋后的次氯酸鈉溶液呈堿性，溶液中殺菌能力較弱的ClO-離子的含量占大多數(shù)，而HClO的殺菌能力大約是ClO-離子的80倍[8-9]。因此將NaClO溶液的pH調(diào)至微酸性，HClO的濃度會極大地增加，溶液的殺菌能力顯著增強。

本文設(shè)計了一臺小型穩(wěn)定性次氯酸消毒液發(fā)生器，通過調(diào)整成分含量和添加穩(wěn)定劑，生產(chǎn)出具有穩(wěn)定性的微酸性HClO溶液，并對該消毒液發(fā)生器的消毒效果、穩(wěn)定性效果以及滅菌機理進行了研究。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

白色念珠菌(CICC 31284)、金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、大腸桿菌(CICC 10899)均由中國工業(yè)微生物菌種保藏中心提供，菌種代數(shù)均為第三代；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基均為人工配制；胰蛋白胨、氯化鈉、次氯酸鈉、稀鹽酸、牛血清白蛋白、硅酸鈉、碳酸氫鈉、無水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、多聚甲醛、乙醇、乙酸異戊酯、硫代硫酸鈉、吐溫-80、重鉻酸鉀、碘化鉀、可溶性淀粉、濃硫酸均為分析純。

BCN-1360型生物操作臺；KF63-DHP9162B電熱恒溫培養(yǎng)箱；DZ11-2恒溫水浴鍋；AE224電子天平；BV01-90-2恒溫磁力攪拌器；BXM-30高壓滅菌鍋；GT10-2離心機；Merlin Compact SEM掃描電子顯微鏡。

1.2 菌懸液制備

將白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌增菌培養(yǎng)后在營養(yǎng)瓊脂斜面接種其中的典型菌落，在37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h。用胰蛋白胨生理鹽水溶液(TPS)輕輕洗滌營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，并稀釋成細菌懸浮液。實驗時，將有機干擾物(30 g/L牛血清白蛋白溶液)加入其中，作等半稀釋，以制備實驗所需的細菌懸浮液。

1.3 微酸性次氯酸消毒液的制備

穩(wěn)定性次氯酸消毒液發(fā)生器結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 穩(wěn)定性次氯酸消毒液發(fā)生器示意圖Fig.1 Schematic diagram of stable hypochlorous acid disinfectant generator1.裝置本體；2.消毒液生成器主柜；3.消毒液生成器副柜；4.酸化水混合罐；5.pH電極與射流器；6.NaClO原液罐；7.自來水導(dǎo)管；8.鹽酸稀釋液罐；9.消毒液儲存罐；10.出液導(dǎo)管；11.主柜內(nèi)艙；12.穩(wěn)定劑添加罐；13.射流器

組裝完成后即可生產(chǎn)出穩(wěn)定性次氯酸消毒液進行消毒實驗，也可以與其他水處理單元串接使用。采用有效氯含量為60 g/L的NaClO溶液和質(zhì)量分數(shù)為2%的鹽酸作為主要原料，生產(chǎn)出穩(wěn)定的微酸性HClO消毒液需要經(jīng)過3道工序：第1道工序為接通自來水，分別將NaClO溶液和鹽酸溶液進行稀釋，并經(jīng)過充分混勻后，進入第2道工序；第2道工序?qū)⒁呀?jīng)充分稀釋的兩種溶液進行攪拌混合，使兩者之間充分發(fā)生反應(yīng)后進入第3道工序；第3道工序在混合液中加入穩(wěn)定劑再次充分混合，即可產(chǎn)出有效氯含量為40～600 mg/L的穩(wěn)定微酸性次氯酸消毒液。另外，在發(fā)生器中獨立設(shè)置了在線pH電極和穩(wěn)定劑添加罐，通過pH電極的檢測防止酸添加過量導(dǎo)致氯氣的產(chǎn)生，提高該生產(chǎn)工藝的安全性。

有效氯含量測定根據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》[10]中規(guī)定的碘量法分別在不同反應(yīng)條件下取樣進行。發(fā)生器工藝流程見圖2。

圖2 穩(wěn)定性次氯酸消毒液發(fā)生器工藝流程圖Fig.2 Process flow chart of stable hypochlorousacid disinfectant generator

1.4 實驗方法

1.4.1 中和劑鑒定實驗 以金黃色葡萄球菌、白色念珠菌作為實驗菌，按照中和劑懸液定量鑒定程序，設(shè)定6組平行實驗。作為實驗結(jié)果，當?shù)?組無細菌生長或細菌數(shù)遠小于第2組，第2組中的菌落數(shù)超過5 cfu/mL，第3，4，5組內(nèi)的菌落數(shù)相對誤差率≤15%，第6組沒有細菌生長時，實驗重復(fù)3次，統(tǒng)計平均值，若結(jié)果一致，表示所用中和劑符合實驗要求。

1.4.2 懸液定量殺菌實驗 將由發(fā)生器產(chǎn)出的消毒液于20 ℃恒溫5 min，取無菌試管向其中加入0.5 mL細菌懸浮液，再加入0.5 mL濃度為30 g/L的牛血清白蛋白溶液和4.0 mL消毒液(使用TPS作為陽性對照)，充分混勻。在反應(yīng)至達到設(shè)定時間后，取0.5 mL上述混合物加入到含有4.5 mL中和劑的試管中，混合10 min后，適當稀釋接種并在37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)。計算消毒液的殺滅對數(shù)值，實驗重復(fù)3次，取其平均值。

1.4.3 消毒液穩(wěn)定性實驗 選擇硅酸鈉和碳酸氫鈉作為穩(wěn)定劑，將不同含量的穩(wěn)定劑加入到發(fā)生器直接產(chǎn)出的消毒液中進行實驗。分別稱取5 g上述兩種穩(wěn)定劑于250 mL燒杯中，攪拌，使其完全溶解，移入500 mL容量瓶中，稀釋至刻度。取5個250 mL磨口玻璃瓶，分別加入200 mL 發(fā)生器產(chǎn)出的消毒液，設(shè)定5組平行實驗，固定硅酸鈉的量,改變碳酸氫鈉的含量。另外設(shè)置空白實驗組,不添加任何穩(wěn)定劑。用碘量法測定在80 ℃條件下放置6 h后的有效氯的含量,選擇使有效氯含量降低最少的穩(wěn)定劑組合，每組實驗重復(fù)3次，取其平均值。

1.4.4 消毒液對細菌表面形態(tài)的損傷 將有效氯含量為80 mg/L的消毒液處理之前和之后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞懸液在4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，然后用1 mL PBS洗滌2次，棄去上清液。 將以上樣品在0.1 mol/L PBS的4%多聚甲醛溶液中重懸，并保持6 h。細菌細胞用30%，50%，70%，80%，90%和100%乙醇溶液連續(xù)脫水，并在每種溶液中處理15 min。脫水后，將樣品浸入乙酸異戊酯/乙醇(1∶1，V/V)中5 min，然后浸入100%乙酸異戊酯中5 min。最后，將細胞在室溫下干燥。通過使用雙面膠帶將電池連接到大型SEM管上，涂上金鈀，使用掃描電鏡進行觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 中和劑實驗結(jié)果

實驗結(jié)果見表1。

表1 中和劑鑒定結(jié)果Table 1 Neutralizer identification results

由表1可知，采用5 g/L Na2S2O3+ 5 g/L吐溫-80的0.03 mol/L PBS溶液可以有效地中和250 mg/L有效氯的消毒液對實驗菌的后續(xù)殺菌作用，該中和劑以及作用后的反應(yīng)物對實驗菌和培養(yǎng)基無不利影響。

2.2 發(fā)生器產(chǎn)出消毒液定量滅菌實驗

實驗結(jié)果見表2。

表2 發(fā)生器產(chǎn)出的消毒液對細菌的殺滅效果Table 2 Germicidal efficacy of disinfectant produced by generator on bacteria

由表2可知，用該發(fā)生器產(chǎn)出150 mg/L有效氯的產(chǎn)品作用5 min，金黃色葡萄球菌的殺滅對數(shù)值為5.26，大腸桿菌為5.78，白色念珠菌為4.21。

2.3 消毒液穩(wěn)定性實驗

向發(fā)生器產(chǎn)出的消毒液中添加Na2SiO3和Na2-CO3，在80 ℃條件下放置6 h的穩(wěn)定效果見表3。

表3 加入穩(wěn)定劑Na2SiO3與Na2CO3的穩(wěn)定效果Table 3 Stabilizing effect of adding stabilizers Na2SiO3 and Na2CO3

由表3可知，不加入任何穩(wěn)定劑的空白對照組，有效氯含量下降了31.26%；加入15 mL Na2SiO3和20 mL Na2CO3的消毒液，有效氯含量下降僅為5.24%，極大地提高了消毒液的穩(wěn)定性，延長其貯存時間，使其適用性更為廣泛。在200 g消毒液中加入0.3 g Na2SiO3和0.4 g Na2CO3作為復(fù)配穩(wěn)定劑，可以有效地延長產(chǎn)出消毒液儲存時長。Na2SiO3和Na2CO3的加入可以使消毒液增粘、增稠，減少溶液分子間的碰撞，降低了消毒液在儲存時的活性，其中Na2CO3的加入還可以抑制反應(yīng)器中由于酸性過高而產(chǎn)生的氯氣。

2.4 次氯酸消毒液對細菌表面形態(tài)的損傷

經(jīng)過有效氯含量為80 mg/L的次氯酸消毒液處理5 min之后，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表面超微結(jié)構(gòu)的變化結(jié)果見圖3。

圖3 細菌表面超微結(jié)構(gòu)觀察圖Fig.3 Ultrastructure of bacterial surfaceA.未經(jīng)處理的大腸桿菌；B.次氯酸消毒液處理的大腸桿菌；C.未經(jīng)處理的金黃色葡萄球菌；D.次氯酸消毒液處理的金黃色葡萄球菌

由圖3可知，未經(jīng)處理的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞表現(xiàn)出完整且具有規(guī)則的形態(tài)(圖A，C)，經(jīng)過次氯酸消毒液處理后，兩種細菌表面均出現(xiàn)明顯地收縮，部分細胞壁塌陷(圖B，D)。細胞表面不可逆轉(zhuǎn)的破壞可能是氯化過程中微生物失活的主要步驟，次氯酸消毒劑會破壞細菌的表面結(jié)構(gòu)，在消毒過程中，位于細胞壁上的肽聚糖的N末端氨基酸可能被氧化，從而導(dǎo)致細菌形態(tài)發(fā)生變化[11]。綜上所述，次氯酸消毒劑確實通過引起嚴重的形態(tài)學(xué)損傷而氧化或滅活細菌細胞。

3 結(jié)論

設(shè)計的新型次氯酸發(fā)生器產(chǎn)出的消毒液具有良好地消毒效果。當產(chǎn)出消毒液有效氯含量為150 mg/L時，分別作用于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌5 min，前兩者殺滅對數(shù)值>5.00，后者殺滅對數(shù)值>4.00，對細菌繁殖體具有良好的殺滅作用。該新型次氯酸發(fā)生器裝置另外安裝穩(wěn)定劑添加罐，每200 g消毒液中加入0.3 g Na2SiO3和0.4 g Na2CO3作為復(fù)配穩(wěn)定劑，使得產(chǎn)出消毒液的穩(wěn)定性極大地提升，可以有效地延長產(chǎn)出消毒液儲存時長。消毒液作用于細菌后對細菌表面形貌造成嚴重損傷，細菌表面出現(xiàn)明顯的裂解與破損，從而起到消毒滅菌的作用。

該新型次氯酸發(fā)生器可以連續(xù)生產(chǎn)出微酸性的次氯酸消毒液，在裝置中設(shè)置了在線pH電極來控制原料液的添加量防止產(chǎn)生氯氣，產(chǎn)出的消毒液具有穩(wěn)定性強、殺菌能力強、安全無腐蝕等優(yōu)點，適用于共公共衛(wèi)生環(huán)境、食品加工、水處理等場景。