郭婷婷，曾俊鵬，彭 斌，李 靜，鄧澤元

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 南昌330047）

甘油二酯（DAG）是指甘油中兩個羥基與脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng)得到的產(chǎn)物，是一種功能性油脂，它分為1，3-甘油二酯和1，2-甘油二酯兩種異構(gòu)體。研究表明其具有減少內(nèi)臟脂肪的積累、控制體重、降低血脂等功效[1-2]。甘油二酯可廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等。相對于化學(xué)法，酶法制備甘油二酯具有反應(yīng)體系條件溫和，產(chǎn)品純度較高，能耗低等優(yōu)勢[3]。以花生油為原料，生產(chǎn)花生油甘油二酯，不但風(fēng)味獨特，而且原料豐富，適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

目前報道分子蒸餾是分離甘油酯的最有效的技術(shù)，該技術(shù)主要有蒸餾溫度低、工作真空度高、物料受熱時間短以及分離效果好等優(yōu)點，適用于高沸點、熱敏性及易氧化物料的分離[4]。近幾年，油脂中的縮水甘油酯和反式脂肪酸受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注?？s水甘油酯對人體具有致癌性，過去日本花王公司生產(chǎn)了“Econa 健康烹調(diào)油”，但隨后檢測機構(gòu)在其中檢測出縮水甘油酯含量超標，致使該產(chǎn)品不能在市場上銷售[5]。研究表明縮水甘油酯形成的過程與其前體物質(zhì)有關(guān)，并將前體物質(zhì)歸結(jié)為單?；视王?、二?；视王?、三?；视王ズ吐萚6-8]。油脂在精煉脫臭過程中，高溫處理會使反式脂肪酸含量增加[9]。油脂中還存在維生素E、植物甾醇等有益成分[10]，在合成及純化過程中會有一定的損失。目前未有對分子蒸餾后花生油甘油二酯有益與有害成分的研究。本試驗通過分子蒸餾純化花生油甘油二酯，研究合成與純化前、后的甘油酯組成、脂肪酸組成、縮水甘油酯（GEs）及營養(yǎng)物質(zhì)的變化。這對加強控制油脂開發(fā)類食品的質(zhì)量安全，以及油脂行業(yè)的發(fā)展和人們的身體健康具有重要的科學(xué)研究意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魯花一級花生油，南昌天虹超市；脂肪酸標品（GLC463 標樣），Nu Chek.Prep 公司；丙三醇、無水硫酸鈉、冰乙酸、氯化鈉等均為分析純級試劑；正己烷、甲醇、叔丁基甲醚、異丙醇、苯硼酸等為色譜純級試劑。Novozym435 脂肪酶，諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；3-氯-1，2-丙二酵（3-MCPDd5），加拿大Toronto Research Chemicals 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2204B 電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；TDL-5-A 低速大容量離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；UIC-KDL1 分子蒸餾，德國UIC 公司；DSY-VI 型氮吹儀，北京金科精華苑科技有限公司；DF101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌鍋，鄭州市亞榮儀器有限公司；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；6890N 型氣相色譜儀，美國Agilent 公司；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司等。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶解法生產(chǎn)甘油二酯 利用Novozym 435脂肪酶在無溶劑體系下通過甘油解反應(yīng)制備甘油二酯，合成條件為：花生油與甘油物質(zhì)的量比1∶2，加酶量6%，反應(yīng)時間12 h，反應(yīng)溫度70 ℃。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)體系進行離心，分離反應(yīng)體系中的脂肪酶后，合成產(chǎn)物低溫儲存。

1.3.2 分子蒸餾工藝研究 采取兩級分子蒸餾從合成產(chǎn)物混合物中分離和純化甘油二酯。首先，進行一級分子蒸餾將產(chǎn)物體系中的脂肪酸、甘油一酯在較低溫度下與?；视突旌衔锓蛛x，一級分子蒸餾條件：蒸餾溫度180 ℃和200 ℃，冷凝溫度20 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，真空度0.1 Pa，進料速率2 mL/min，然后通過二級分子蒸餾在200 ℃溫度以上從甘油三酯中分離出甘油二酯，考察二級分子蒸餾溫度對甘油二酯純度和得率的影響。

1.3.3 甘油酯純度測定 采用正相高效液相色譜法測定[11]。測定條件：檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器（Model 300S，美國Softa 公司）；色譜柱：Hypersil BDS CPS （5 μm，250 mm×4.6 mm，美國Thermo 公司）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；樣品質(zhì)量濃度：0.2 mg/mL 正己烷；流動相：正己烷（溶有0.4%的乙酸）和叔丁基甲醚（溶有0.4%乙酸）。采用梯度洗脫，洗脫程序：0～5 min，100%正己烷；5～15 min，100%～20%正己烷；15～17 min，20%正己烷；17～17.1 min，20%～100%正己烷；17.1～20 min，100%正己烷。某種甘油酯的含量表示為該種甘油酯的峰面積占總的甘油酯峰面積的百分比。

甘油二酯的純度定義為[12]：

式中，MAG （%）——產(chǎn)物中甘油一酯含量；DAG（%）——產(chǎn)物中甘油二酯含量；TAG（%）——產(chǎn)物中甘油三酯含量；FFA（%）——產(chǎn)物中游離脂肪酸的含量。

1.3.4 理化性質(zhì)測定 酸價采用GB5009.229-2016 測定；過氧化值采用GB5009.227-2016 測定；色澤采用GB/T 22460-2008 動植物油脂 羅維朋色澤的測定。

1.3.5 甘油三酯總脂肪酸組成分析 甘油三酯的脂肪酸組成參照本試驗堿法甲基化方法[13]：取2 mg 甘油三酯，溶于1.5 mL 正己烷，加入40 μL 乙酸甲酯和100 μL（0.5 mol/L）甲醇鈉溶液，渦流混勻1 min，37 ℃下反應(yīng)20 min 后，置于冰箱下層-20 ℃冷凍10 min，取出后立即加入60 μL 草酸溶液，離心棄去沉淀，N2吹干，GC 分析甘油三酯脂肪酸組成。

1.3.6 氣相色譜分析 色譜條件參照Cruz-Hernandez 等[14]，色譜柱為CP-Sil88 熔融石英毛細管柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm）。載氣為H2，燃燒氣為H2、N2和空氣。FID 溫度250 ℃，進樣口溫度250 ℃。氣相色譜程序升溫的時間為86 min：45 ℃保持4 min，以13 ℃/min 的升溫速率將溫度升至175 ℃，保持27 min 后再以4 ℃/min 的升溫速率升至215 ℃，保持35 min。脂肪酸的分析參照標準圖譜，脂肪酸的百分含量采用面積歸一化法確定（以峰值面積的百分比表示）。

1.3.7 縮水甘油酯的測定[15]樣品處理：稱取2份油樣0.1 g 于100 μL 甲基叔丁基醚中，再向油樣中加入1 μg 3-MCPD-d5，分別標記為A，B，渦旋振蕩兩支試管至油樣完全溶解。再向溶液中加入25 g/L 甲醇鈉的甲醇溶液200 μL，渦旋1 min。酯交換反應(yīng)的時間要控制在3.5～5.5 min 內(nèi)，不斷渦旋直至反應(yīng)液澄清，試管A 中加入600 μL 酸化的氯化鈉溶液（200 g/L），試管B 中加入600 μL 酸化的溴化鈉溶液（600 g/L）終止酯交換反應(yīng)。充分反應(yīng)后，兩支試管中再分別加入600 μL 的正己烷溶液，蓋上蓋子充分渦旋后離心5 min （4 000 r/min），待反應(yīng)液分層后去除有機層。此步驟重復(fù)3次。衍生反應(yīng)：對于A，B 試管，分別用600 μL 乙醚/乙酸乙酯混合溶劑（3∶2）反萃取其水相，充分渦旋后離心5 min（4 000 r/min），待溶液分層后把有機相合并在裝有少量無水硫酸鈉的2 mL 離心管中，此步驟重復(fù)3 次。再分別向有機相中加入200 μL 衍生化試劑（PBA 溶于乙醚中飽和），充分渦旋后在30 ℃下反應(yīng)20 min。純化復(fù)溶：衍生化反應(yīng)結(jié)束后，用小氣流氮氣吹干，氮吹溫度為45℃。氮吹完后，加入500 μL 異辛烷復(fù)溶，充分渦旋后離心1 min（6 000 r/min），取200 μL 上層清液轉(zhuǎn)移至GC 瓶中，供GC-MS 分析。氣相色譜測定條件：不分流進樣，進樣體積1 μL，載氣為He，1.2 mL/min 恒速流動；升溫程序為60 ℃，以6 ℃/min上升至130 ℃，保持8 min，再以20 ℃/min 上升至250 ℃并保持5 min。質(zhì)譜條件：EI＋，SIM 模式；EI離子源溫度230 ℃，EI 電離能量70 eV；接口溫度280 ℃；溶劑延遲6 min；選擇3-MCPD-d5 m/z 為201，150；3-MCPD m/z 為196，147 定性定量。

1.3.8 甾醇的測定[16-18]精確稱取0.05～0.1 g（精確至0.1 mg）的樣品置于帶蓋的試管中，加入5.0 mL 2 mol/L 氫氧化鉀的乙醇溶液后加蓋密封，劇烈振搖30 s，置于60 ℃水浴中皂化1 h，并保持振搖，用水冷卻至室溫后加入1.0 mL 二次水和4.0 mL 正己烷，密封后劇烈振搖，靜置，將上層（正己烷層）轉(zhuǎn)移至另一試管中，用N2吹干正己烷后加入1 mL 甲醇溶解，用0.45 μm 微孔濾膜濾過并轉(zhuǎn)至進樣瓶中，在試驗設(shè)定條件下進行HPLC 測定。液相色譜分析條件參見江海[16]、馮妹元等[17]和牟德華等[18]的方法，并在此基礎(chǔ)上作少許改動，采用二極管陣列檢測器（DAD），條件如下：色譜柱：Hypersil ODS2-C18 （5 μm，4.6 mm 150 mm）流動相：純甲醇。流速：1.0 mL/min。檢測波長：210 nm。柱溫：30 ℃。進樣量：10 L。分析時長：20 min。

1.3.9 維生素E 的測定[19]稱取一定量VE 標品，記錄下質(zhì)量，用正己烷定容。再從其中依次分別精確移取0.5，1，2，3，4，6 mL，稀釋至10 mL。采用HPLC 分析，每個樣品平行測3 次，繪制標準曲線。樣品預(yù)處理：準確稱取1 g 菜籽油于10 mL 棕色容量瓶中，正己烷定容。經(jīng)0.45 μm 有機膜過濾后進樣。

色譜柱：依利特Hypersil ODS2 （5 μm，4.6 mm×150 mm），流動相為甲醇：水（體積比98∶2），進樣5 μL，流速設(shè)置為0.8 mL/min，紫外檢測波長：λex=295 nm，柱溫：25 ℃。

1.4 統(tǒng)計方法

用SPSS 20.0 對數(shù)據(jù)進行分析以及圖表繪制，檢測結(jié)果用Mean±SD 表示；所有試驗均重復(fù)3次以上，并且用單因素方差分析比較均值，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 合成及分子蒸餾前、后甘油酯組成液相色譜圖

圖1 標準品、合成產(chǎn)物、分子蒸餾一次及二次液相圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of standard，synthesis product，one and two-step molecular distillation

圖1分別為混合甘油酯標準品、合成甘油酯及分子蒸餾一次和二次的液相圖譜，橫坐標為時間，縱坐標為響應(yīng)信號，出峰順序依次為FFA、TAG、1，3-DAG、1，2-DAG 和MAG，分離效果很好。分子蒸餾一次后可除去游離脂肪酸和甘油一酯。分子蒸餾二次后可只保留甘油二酯組分。

2.2 分子蒸餾前、后甘油酯組成含量及得率

分子蒸餾是一種在高真空下操作的蒸餾方法，這時蒸氣分子的平均自由程大于蒸發(fā)表面與冷凝表面之間的距離，從而可利用料液中各組分蒸發(fā)速率的差異，對液體混合物進行分離。當(dāng)溫度越高時，分子運動平均自由程越大，則輕、重組分分離效果越好，但高溫會使所分離物質(zhì)的品質(zhì)受到一定程度的影響，如顏色會加深。因而蒸發(fā)面溫度是影響分離效果的關(guān)鍵因素[20]。

表1 分子蒸餾前、后甘油二酯的含量及得率Table 1 Compositions and yield of DAG before and after molecular distillation

如表1所示，利用酶法合成甘油酯中甘油二酯的純度為45%，經(jīng)過180 ℃和200 ℃分子蒸餾后，除去了甘油一酯和游離脂肪酸，甘油二酯提高到65%以上。當(dāng)對一次分子蒸餾產(chǎn)物進行二次分子蒸餾后，隨著溫度的升高，甘油二酯的純度可達88%，這是因為隨著蒸發(fā)面溫度的升高，物料中輕組分獲得的能量更多，分子運動加劇，快速餾出。但甘油二酯產(chǎn)率較低，仍有甘油二酯流入重相[21]。

2.3 分子蒸餾前、后脂肪酸及反式脂肪酸組成及含量

油脂中的不飽和脂肪酸在高溫條件下易產(chǎn)生反式脂肪酸，因此對反應(yīng)前后及分子蒸餾產(chǎn)物脂肪酸組成及含量進行測定。

由表2可知，花生油甘油二酯經(jīng)分子蒸餾后脂肪酸組成變化不大，仍以油酸和亞油酸為主，棕櫚酸與硬脂酸其次，但不飽和脂肪酸遠高于飽和脂肪酸。從產(chǎn)物中甘油二酯和甘油三酯的脂肪酸組成可知，各種脂肪酸與甘油或者甘油酯酯化的機會不均等，Selmi 等[22]比較過不同鏈長飽和脂肪酸及相同鏈長不同不飽和度的不飽和脂肪酸的酯化機會，研究發(fā)現(xiàn)在酯化的過程中，C14-C18 的飽和脂肪酸酯化速度最快，其次為C18：1等單不飽和脂肪酸，最后為C18：2和C18：3等多不飽和脂肪酸。因此反應(yīng)產(chǎn)物中的甘油二酯和甘油三酯中飽和脂肪酸增加。

油脂在高溫加熱過程中易形成反式脂肪酸[23]，合成產(chǎn)物中順式油酸9c-C18：1高溫異構(gòu)化后形成了極少量的9t-C18：1；順式亞油酸9c12c-C18：2高溫異構(gòu)化形成了9c12t-C18：2，9t12c-C18：2和少量的9t12t-C18：2；Li 等[24]對亞油酸異構(gòu)化的研究認為，形成單反式脂肪酸僅需跨越一個能壘，因此在一定時間范圍內(nèi)含量更高。分子蒸餾過程溫度雖在180 ℃和220 ℃，但反應(yīng)時間較短，因此反式脂肪酸含量較低，僅從0.75%增加至1.2%，未超過國家規(guī)定3%?？刂聘邷貢r間，是控制油脂中反式脂肪酸含量的有效途徑。

2.4 分子蒸餾溫度對縮水甘油酯的含量的影響

由圖2所示原料花生油及合成甘油酯中縮水甘油酯的含量很低，說明酶催化反應(yīng)過程中不會產(chǎn)生縮水甘油酯，該結(jié)果與文獻報導(dǎo)[25]的結(jié)果是一致的。經(jīng)不同溫度下一次及二次分子蒸餾后，當(dāng)溫度超過220 ℃后，縮水甘油酯的含量急劇增加，富集在輕相甘油二酯中。Craft 等[6-7]發(fā)現(xiàn)甘油二酯與縮水甘油酯的形成有很強的相關(guān)性。Shimizu等[26]對二油酸甘油酯在180 ℃到240 ℃下封閉熱處理產(chǎn)生3-MCPD 酯和縮水甘油酯的趨勢進行考察，發(fā)現(xiàn)縮水甘油酯的產(chǎn)生量隨溫度的升高而增加，且當(dāng)熱處理溫度高于220 ℃時油酸縮水甘油酯的產(chǎn)生量迅速增加，對于二次分子蒸餾后的甘油二酯會含至少2 mg/kg 的縮水甘油酯，如要提高得率，需要進行縮水甘油酯的去除。因此分子蒸餾溫度是影響縮水甘油酯產(chǎn)生的重要因素。

表2 反應(yīng)前、后及分子蒸餾產(chǎn)物脂肪酸組成及含量Table 2 Fatty acid compositions of product before and after the reaction and molecular distillation

圖2 分子蒸餾溫度對縮水甘油酯含量的影響Fig.2 Effect of molecular distillation temperature on the content of glycidyl ester

2.5 分子蒸餾前、后理化性質(zhì)的變化

由表3所示產(chǎn)物相關(guān)理化性質(zhì)的檢測，合成產(chǎn)物會生成游離脂肪酸，因此酸價較高。分子蒸餾后脫去了游離脂肪酸及過氧化物后其酸價和過氧化值降低，其值都在國標范圍內(nèi)，但高溫會使所分離物質(zhì)的品質(zhì)受到一定程度的影響，如顏色會加深[20]。因此分子蒸餾后油脂顏色加深，縮水甘油酯的含量在220 ℃條件以下會有一定量的累積，因此考慮甘油二酯的得率的同時需檢測縮水甘油酯的含量并除去。

2.6 分子蒸餾前、后植物甾醇和維生素E 的含量變化

由表4所示油脂中營養(yǎng)物質(zhì)的變化，花生油中含有VE 32.76 mg/100 g 和甾醇318.46 mg/100 g，反應(yīng)合成前后和分子蒸餾前后維生素E 和甾醇都有一定量的損失，維生素E 損失最高，分子蒸餾一次后損失率達43%，高溫和高真空會使油脂發(fā)生輕微氧化，氧化時一般先損耗包括VE 在內(nèi)的抗氧化成分，因此維生素E 損失率嚴重。有研究表明[27]分子蒸餾可以富集維生素E 和甾醇，DAG 中VE 和甾醇有累積，但是需要額外添加抗氧化劑等營養(yǎng)成分。

表3 反應(yīng)前、后及分子蒸餾產(chǎn)物理化性質(zhì)的變化Table 3 Changes of physicochemical properties of product before and after the reaction and molecular distillation

表4 反應(yīng)前、后及分子蒸餾產(chǎn)物植物甾醇和VE 含量的變化Table 4 Changes of phytosterol and VE content of product before and after the reaction and molecular distillation

3 結(jié)論

本試驗通過分子蒸餾技術(shù)純化花生油甘油二酯。在180 ℃分子蒸餾一次后可除去游離脂肪酸和甘油一酯，220 ℃二次分子蒸餾后可得到純度85%，得率18.54%的甘油二酯，分子蒸餾后脂肪酸組成變化不大，其中飽和脂肪酸增加，反式脂肪酸含量較低，僅從0.75%增加至1.2%，當(dāng)溫度超過220 ℃后，縮水甘油酯的含量急劇增加，因此二次分子蒸餾的溫度不應(yīng)超過220 ℃。根據(jù)理化性質(zhì)分析，花生油甘油二酯符合國家標準。分子蒸餾前后營養(yǎng)成分均會減少，維生素E 的含量從32.76降到19.43 mg/100 g，損失40%左右，植物甾醇的含量從318.46 降到248.6 mg/100 g，損失22%左右，本研究為分子蒸餾純化甘油二酯提供理論支持。