陳 境，張曉寧，麻麗麗，鄂晶晶，王俊國(guó)

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特010018）

益生菌有助于維持宿主腸道菌群的組成和良好的平衡，可增強(qiáng)宿主對(duì)病原體侵入的抵抗力，對(duì)腸道健康、代謝紊亂和大腦健康等具有多種有益作用[1-2]。為了更好地利用益生菌，可通過(guò)真空冷凍干燥技術(shù)制備益生菌菌粉與益生菌發(fā)酵劑等。此技術(shù)是在低溫且真空狀態(tài)下，具備酶活性喪失少，保存期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[3-5]。然而，在此過(guò)程中，要經(jīng)受冷凍和干燥脫水兩個(gè)極端環(huán)境，不可避免地易造成部分細(xì)胞損傷[6]，如關(guān)鍵酶的失活、細(xì)胞膜損傷等因素，導(dǎo)致生理活性喪失甚至死亡[7-8]。益生菌需在腸道內(nèi)以足夠的豐度存活才能起到一定作用[9]，通常是不低于7 lg（CFU/mL），而提高菌株的抗冷凍干燥活性，減少冷凍干燥對(duì)益生菌的酶活及細(xì)胞膜的損傷是關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)：通過(guò)改變培養(yǎng)基成分[10]，添加凍干保護(hù)劑及調(diào)整冷凍干燥工藝條件等方式可提高凍干乳酸菌的活力[11-12]。盡管有研究表明通過(guò)改變培養(yǎng)條件可以提高凍干乳酸菌的活力，但鮮有研究解析其內(nèi)在機(jī)理。

本試驗(yàn)中探究了不同初始pH 值培養(yǎng)條件對(duì)植物乳桿菌LIP-1 抗冷凍干燥性能的影響，并測(cè)定凍干后植物乳桿菌LIP-1 的關(guān)鍵酶活性和細(xì)胞膜脂肪酸含量的變化以及細(xì)胞膜損傷，探究改變初始pH 值培對(duì)植物乳桿菌抗冷凍干燥的影響機(jī)理，為進(jìn)一步提高乳酸菌的抗冷凍干燥活性提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌LIP-1 （Lactobacillus plantarum LIP-1）是一株分離自新疆地區(qū)酸馬奶中，具有降血脂功能的益生菌植物乳桿菌[13]。由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

優(yōu)化MRS 培養(yǎng)基：蔗糖33.35 g，大豆蛋白胨2.95 g，酵母粉2.95 g，酪蛋白胨4.91 g，K2HPO43.3 g、乙酸鈉8.25 g、檸檬酸鈉3.3 g，VB10.04g，L-半胱氨酸0.05 g，MnSO4·5H2O 0.12 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，吐溫80 1 g。

脫脂乳粉，恒天然有限公司；MRS 液體培基、MRS 瓊脂培養(yǎng)基，英國(guó)Oxoid 試劑公司；LIVE/DEAD BacLight Bacteiral Viability Kit L7012 試劑盒；酶活性測(cè)定試劑盒，索來(lái)寶試劑公司；脂肪酸提取試劑（氯仿有機(jī)色譜純、甲醇、甲醇鈉-甲醇、正己烷等）。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3750 型滅菌鍋、STAC-S45F 型恒溫培養(yǎng)箱，日本三洋公司；KDC-1044 型低速離心機(jī)，安徽中佳科儀有限公司；高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9272 型），上海一恒公司；超低溫冰箱，中國(guó)海爾集團(tuán)公司；pH 計(jì)，瑞士Mettler Toledo 公司；萊卡熒光顯微鏡DM4000B，上海徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司；ZHJH-1214B 超凈工作臺(tái)，南京依貝儀器設(shè)備有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，日本三洋MLS-3750；真空冷凍干燥機(jī)，Labconco FreeZone；全自動(dòng)干熱滅菌器（ADVANTEC SP-650 型），廣州綠百草科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化培養(yǎng) 將植物乳桿菌LIP-1 接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)活化。待凝乳后再以2%的體積分?jǐn)?shù)接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)18 h。然后在植物乳桿菌LIP-1 經(jīng)37 ℃活化培養(yǎng)2 代。

1.3.2 菌種的凍干處理 將活化培養(yǎng)好的菌樣進(jìn)行預(yù)凍處理，預(yù)凍溫度及預(yù)凍時(shí)間為-80 ℃，10 h，保護(hù)劑與菌體（菌體濃度調(diào)整為1010CFU/g 左右）比例6∶1。真空冷凍干燥18 h 后即為凍干樣。

1.3.3 最適初始培養(yǎng)pH 值的確定 以優(yōu)化培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，用1 mol/L 的鹽酸和1 mol/L 的氫氧化鈉對(duì)優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行初始培養(yǎng)pH 值的調(diào)節(jié)[14]。利用單因素試驗(yàn)，將優(yōu)化后的培養(yǎng)基初始培養(yǎng)pH值分別調(diào)至5.0，5.6，6.2，6.8，7.4。在37 ℃下，將培養(yǎng)的第2 代菌株在不同初始pH 值的優(yōu)化培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)18 h。通過(guò)計(jì)算活菌數(shù)以確定發(fā)酵活菌數(shù)最高的最適初始培養(yǎng)pH 值 （將凍前菌樣與凍后菌樣分別進(jìn)行精確計(jì)數(shù)，凍后活菌數(shù)與凍前活菌數(shù)之比即為菌樣的凍干存活率）。在此得到發(fā)酵菌數(shù)相似，但凍干存活率存在顯著差異的2 組（P＜0.05），由此選取試驗(yàn)組與對(duì)照組后，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。本研究對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)的菌株進(jìn)行不同時(shí)間下培養(yǎng)pH 值的測(cè)定，直至18 h 收獲菌樣（測(cè)定培養(yǎng)過(guò)程中pH 值變化趨勢(shì)）。

1.3.4 菌發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中pH 值、生長(zhǎng)量及菌體密度的變化 利用優(yōu)化后的不同pH 值培養(yǎng)基分別對(duì)植物乳桿菌LIP-1 進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每3 h 測(cè)定一次pH 值，根據(jù)結(jié)果繪制折線圖。在這些時(shí)間點(diǎn)（即3，6，9，12，15，18 h）分別對(duì)菌進(jìn)行菌體密度及生長(zhǎng)量的測(cè)定并繪圖。

1.3.5 細(xì)胞膜脂肪酸的提取與測(cè)定

1）細(xì)胞膜脂肪酸的提取 本試驗(yàn)利用Bligh&Dyer 法提取菌體細(xì)胞膜的脂肪酸[15]，甲酯化后進(jìn)行萃取。按照步驟，首先用無(wú)菌去離子水對(duì)經(jīng)不同pH 值處理的凍干后菌樣 （試驗(yàn)組與對(duì)照組）復(fù)水后離心洗滌3 次 （4 000 r/min，4 ℃，10 min）。棄上層清液后，分別稱取菌泥0.5 g，向其中加入1.9 mL 氯仿-甲醇溶液（以氯仿∶甲醇體積比為1∶2 的條件制備溶液），劇烈振蕩15 min。加入0.625 mL 氯仿及0.625 mL 無(wú)菌去離子水，充分振蕩15 min 后，離心10 min（4 ℃，8 000 r/min）。此時(shí)溶液分層，吸取下層液相，分別移至無(wú)菌離心管內(nèi)。氮吹30 min 后，以甲醇鈉-甲醇溶液（1 mol/L）做催化劑，分別加1 mL 于離心管內(nèi)，在冰浴條件下振搖5 min 進(jìn)行甲酯化。用0.625 mL 正己烷萃取脂肪酸甲酯，離心5 min（4 ℃，8 000 r/min），吸取上層清液后經(jīng)有機(jī)系過(guò)濾器移至氣相瓶后進(jìn)行細(xì)胞膜脂肪酸含量的測(cè)定。

2）細(xì)胞膜脂肪酸含量測(cè)定 氣相色譜條件：PEG 毛細(xì)管填充柱（60 m×0.22 mm，0.25 μm film，Restek）；載氣：氮?dú)猓涣魉伲?5 mL/min；總流量：18.8 mL/min；柱壓：20 kPa；柱溫箱由初始6.5 ℃/min 的速率增至40 ℃/min，此時(shí)溫度為230 ℃并在230 ℃保持35.58 min。脂肪酸的峰面積、各自的保留時(shí)間和質(zhì)譜范圍根據(jù)標(biāo)樣進(jìn)行比對(duì)（西格瑪37 種脂肪酸標(biāo)樣和環(huán)丙烷脂肪酸標(biāo)樣），對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)定。

1.3.6 細(xì)胞膜完整性的測(cè)定 利用LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability 試劑，將熒光染料PI和SYTO9 等體積混合均勻，取2 μL 混合染料，分別加至1 mL 菌液中，振蕩混合均勻，在室溫避光孵育10～15 min。取5 μL 染好色的菌懸液，滴加至潔凈的載玻片后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.7 酶活性測(cè)定 用β-半乳糖苷酶 （β-GAL）試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、ATP 酶試劑盒、己糖激酶（HK）試劑盒、丙酮酸激酶（PK）試劑盒對(duì)2 組樣品進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7.1 無(wú)細(xì)胞提取液的制備 將冷凍干燥后的試驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)菌菌液離心，離心洗滌2 次后棄上清液，加入1 mL 細(xì)胞提取液 （500 萬(wàn)細(xì)胞數(shù)），以功率20%，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30 次進(jìn)行超聲波破碎。8 000×g，4 ℃離心10 min 取上清液，置于冰浴中待測(cè)。

1.3.7.2 酶活力的測(cè)定 用β-半乳糖苷酶 （β-GAL）活性檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測(cè)試劑盒、ATP 酶活性檢測(cè)試劑盒、己糖激酶（HK）活性檢測(cè)試劑盒、丙酮酸激酶（PK）活性檢測(cè)試劑盒分別對(duì)經(jīng)不同初始pH 值進(jìn)行培養(yǎng)后的凍干菌樣樣品進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)酶活單位用U 表示。

1.3.8 數(shù)據(jù)的處理 所有數(shù)據(jù)每組各3 個(gè)平行樣，使用R 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Wilcox 檢驗(yàn)法統(tǒng)計(jì)分析其顯著性，P≤0.05 為顯著。并使用Graph Pad 7.0 軟件完成相關(guān)圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同初始培養(yǎng)pH 值對(duì)植物乳桿菌LIP-1抗冷凍干燥性能的影響

如圖1可知，在培養(yǎng)基不同起始pH 值的條件下，植物乳桿菌LIP-1 的高密度發(fā)酵活菌數(shù)隨起始pH 值的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，表明不同起始pH 值對(duì)菌株的生長(zhǎng)及代謝有顯著影響。

當(dāng)初始培養(yǎng)pH 值分別為6.8 與7.4 時(shí)，發(fā)酵活菌數(shù)較高，分別為9.79，9.70 lg（CFU/mL），且無(wú)顯著性差異變化（P＞0.05），但凍干存活率分別為81.76%，72.43%，具有顯著性差異（P＜0.05）。為了減少影響因素，本研究選擇發(fā)酵菌數(shù)相似，但凍干存活率存在顯著差異的2 組進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，即以初始pH 值為6.8 培養(yǎng)的LIP-1 作為試驗(yàn)組，以初始pH 值為7.4 的LIP-1 作為對(duì)照組，來(lái)進(jìn)一步探究不同初始pH 值對(duì)乳桿菌抗冷凍干燥活性的內(nèi)在影響機(jī)制。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中pH 值和菌體生長(zhǎng)量的變化

對(duì)試驗(yàn)組（初始pH 值為6.8）與對(duì)照組（初始pH 值為7.4）發(fā)酵過(guò)程中pH 值的變化、菌的生長(zhǎng)量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。

圖1 不同初始pH 值培養(yǎng)對(duì)植物乳桿菌LIP-1抗冷凍性的影響Fig.1 Effect of different initial pH on the anti-freezing property of Lactobacillus plantarum LIP-1

圖2 經(jīng)不同初始pH 值培養(yǎng)的菌株其發(fā)酵過(guò)程pH 值及生長(zhǎng)量的變化Fig.2 Effect of different initial pH on medium fermented pH and cell growth of Lactobacillus plantarum LIP-1

當(dāng)初始pH 值為6.8 和7.4 時(shí)，發(fā)酵液pH 值和菌株活菌數(shù)的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)一致，pH 值在培養(yǎng)后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)而活菌數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。發(fā)酵第3 h 后，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組pH 值降低得更快，活菌數(shù)增長(zhǎng)更多，最后均趨于穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)初始pH 值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響與酶的活性密切相關(guān)[16]，適宜的初始pH 值，可以使酶活性增加，促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)。我們認(rèn)為pH 6.8 作為最適初始pH 值，可以使植物乳桿菌相關(guān)的酶活性增加，促進(jìn)其生長(zhǎng)。與本研究相似，詹蘭蘭等[17]研究發(fā)現(xiàn)，初始pH 值能顯著影響乳酸菌菌株E2和D2的生長(zhǎng)。

在6 h 之后至發(fā)酵終點(diǎn)18 h，試驗(yàn)組所處pH值均在5.2 以下，而對(duì)照組在14 h 以后pH 值才達(dá)到5 以下水平，且發(fā)酵終點(diǎn)試驗(yàn)組pH 值低于對(duì)照組，這表明試驗(yàn)組的pH 值下降更快，植物乳桿菌LIP-1 所處低酸生長(zhǎng)環(huán)境時(shí)間更長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)的低酸環(huán)境能激起菌株的脅迫耐受機(jī)制，菌株因此獲得抗應(yīng)激性，從而能使細(xì)胞更好地抵抗冷凍和脫水[17]，因此與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組長(zhǎng)時(shí)間的酸脅迫引起了植物乳桿菌LIP-1 的脅迫耐受機(jī)制，從而提高了其抵御冷凍干燥的能力，試驗(yàn)組的凍干存活率也因此明顯高于對(duì)照組 （參見(jiàn)圖1）。

與本研究結(jié)果相似，Streit 等[18]對(duì)保加利亞乳桿菌冷脅迫耐受的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)pH 5.25 低酸性環(huán)境培養(yǎng)后，細(xì)胞對(duì)冷凍脅迫的耐受能力顯著提高（P＜0.05）。Li 等[19]對(duì)酒類酒球菌（O.oeni）抗凍干性能的研究發(fā)現(xiàn)酸性條件的培養(yǎng)促進(jìn)了酒類酒球菌的抗凍干作用，因此有較高的冷凍干燥存活率。此外，Chu-Ky 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)釀酒酵母UP3OY5 菌株在低酸環(huán)境下培養(yǎng)再進(jìn)行冷凍干燥處理，酸環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞（79.9%）的活力顯著高于未經(jīng)酸環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞（40.5%）的活力，且在冷凍干燥處理后能更好地存活。所以對(duì)植物乳桿菌LIP-1而言，經(jīng)初始pH 6.8 培養(yǎng)所營(yíng)造的低酸環(huán)境提高了其對(duì)冷凍干燥的耐受性，從而提高了凍干存活率。

2.3 不同初始培養(yǎng)pH 值對(duì)植物乳桿菌LIP-1細(xì)胞膜脂肪酸的影響

如表1所示，植物乳桿菌LIP-1 細(xì)胞膜的脂肪酸組分主要有8 種，分別是C12：0（月桂酸）、C14：0（肉豆蔻酸）、C16：0（棕櫚酸）、C16：1（棕櫚油酸）、C18：0（硬脂酸）、C18：1（油酸）、19cyc （環(huán)丙烷脂肪酸）和C18：2（亞油酸），這些脂肪酸約占總脂肪酸含量的86%以上，除此之外還檢測(cè)到一些其它脂肪酸（C4：0，C6：0，C8：0，C10：0，C14：1，C15：0，C17：0，C18：1t，C18：3），因所占比例較少所以未列入表中。

由表1可知，試驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞膜脂肪酸含量不同，特別是不飽和脂肪酸及環(huán)丙烷脂肪酸的含量，除C16：1不顯著以外，其余試驗(yàn)組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。發(fā)酵過(guò)程中的pH 值變化使細(xì)胞膜上的脂肪酸成分發(fā)生改變[20]。有研究表明低pH 值的生長(zhǎng)環(huán)境可促進(jìn)細(xì)胞膜環(huán)丙烷脂肪酸的合成并提高不飽和脂肪酸的含量[21-25]，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致，較對(duì)照組而言，試驗(yàn)組適宜的初始pH 值（6.8）促進(jìn)了菌的生長(zhǎng)代謝，并使pH 值快速下降（見(jiàn)圖2），使植物乳桿菌LIP-1 長(zhǎng)期處在低pH 值的生長(zhǎng)環(huán)境，進(jìn)而提高了細(xì)胞膜環(huán)丙烷脂肪酸和不飽和脂肪酸的含量。脂肪酸含量的改變是菌株LIP-1 在低pH 值的生長(zhǎng)環(huán)境中所發(fā)生的應(yīng)激反應(yīng)。

表1 不同初始pH 值培養(yǎng)下植物乳桿菌LIP-1冷凍干燥后細(xì)胞膜脂肪酸的相對(duì)含量Table 1 The relative contents of fatty acids in cell membrane after freeze-drying of Lactobacillus plantarum LIP-1 under different initial pH values

在低溫下保持細(xì)胞膜的流動(dòng)性是微生物耐冷機(jī)理中的關(guān)鍵，而脂肪酸的種類和組成是細(xì)胞維持膜流動(dòng)性的要素[26]，細(xì)胞膜脂肪酸含量變化的不同使菌株對(duì)冷凍干燥有不同耐受性[27]，環(huán)丙烷及不飽和脂肪酸的增加會(huì)使細(xì)胞膜維持較好的流動(dòng)性水平，增強(qiáng)菌株的冷凍干燥抗性[28-30]。

Smittle 等[31]提出環(huán)丙烷脂肪酸可以防止脂質(zhì)在細(xì)胞膜中緊密的堆積，使其在暴露于低溫時(shí)更具彈性和靈活性。也有研究的結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相符，因?yàn)榄h(huán)丙烷脂肪酸的增加提高了菌株的抗冷凍干燥活性[28]，Jesus 等[32]證實(shí)了環(huán)丙烷脂肪酸升高對(duì)惡臭假單胞菌抗冷凍干燥性能影響的重要性。Li 等[19]研究證明酒類酒球菌的冷凍干燥存活率升高，與C19cyc11 的富集顯著相關(guān)。Wang 等[33]也發(fā)現(xiàn)冷凍貯藏期間嗜酸乳桿菌細(xì)胞的高抗性與環(huán)丙烷脂肪酸高濃度有關(guān)。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)高含量的不飽和脂肪酸可以提高細(xì)胞膜對(duì)冷凍干燥的抵抗力[33]，張?bào)薜萚34]發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)率先闂U菌保加利亞亞種FL6 細(xì)胞膜不飽和脂肪酸含量顯著增加（P＜0.05），U/S 比值升高時(shí)，菌株對(duì)凍干的抵抗力增強(qiáng)。陳聲明等[35]的研究表明，在低溫干燥條件處理后，釀酒酵母 （Saccharomyces cereuisiae）F159自身調(diào)節(jié)了脂肪酸的不飽和度，增加了細(xì)胞膜不飽和脂肪酸含量使細(xì)胞膜保持流動(dòng)狀態(tài)以此更好地維持了細(xì)胞活性，提高了抗冷凍干燥性能。

圖3 不同初始pH 值培養(yǎng)對(duì)植物乳桿菌LIP-1 冷凍干燥后膜脂肪酸總離子圖Fig.3 The total ionic figure of membrane fatty acids after freeze - drying of Lactobacillus plantarum LIP-1 cultured at different initial pH values

據(jù)此，初始pH 6.8 的培養(yǎng)可以使植物乳桿菌LIP-1 長(zhǎng)期處在低pH 值的生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞膜環(huán)丙烷脂肪酸的合成以及飽和脂肪酸向不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)化，提高了脂肪酸的不飽和度。通過(guò)改變細(xì)胞膜脂肪酸的組成保持了菌株細(xì)胞膜在低溫環(huán)境下的流動(dòng)性，從而提高了菌體抗冷凍干燥活性。

2.4 細(xì)胞膜完整性的測(cè)定

LIVE/DEAD BacLight 試劑盒中包含2 種染料SYTO-9 和PI，SYTO-9 可對(duì)具完整細(xì)胞膜的細(xì)菌進(jìn)行染色并呈現(xiàn)綠色，而PI 染料由于細(xì)胞膜破損進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使其呈現(xiàn)紅色，因此通過(guò)染色可以說(shuō)明經(jīng)冷凍干燥處理后菌體細(xì)胞膜完整性的保持情況[36]。研究已經(jīng)證明細(xì)胞膜的破損直接會(huì)導(dǎo)致菌株的死亡[37-38]，對(duì)經(jīng)過(guò)冷凍干燥后的植物乳桿菌LIP-1 進(jìn)行染色，如圖4所示，紅色熒光代表經(jīng)真空冷凍干燥處理后已死亡的菌，而綠色熒光代表依然存活的菌。

試驗(yàn)組的菌株比對(duì)照組的存活率更高，即發(fā)綠色熒光更多，紅色熒光較少。這一結(jié)果與凍干后細(xì)胞存活率相一致，試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組。這說(shuō)明經(jīng)冷凍干燥處理后，試驗(yàn)組的菌體細(xì)胞膜完整性保持得較好；而對(duì)照組細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，細(xì)胞活性降低。

圖4 不同初始pH 值培養(yǎng)對(duì)冷凍干燥后LIP-1細(xì)胞膜完整性的影響Fig.4 Effect of different initial pH on the cell membrane integrity of LIP-1 after freeze-drying

因?yàn)樵囼?yàn)組經(jīng)初始pH 6.8 的培養(yǎng)，LIP-1 長(zhǎng)久處于低酸生長(zhǎng)環(huán)境下，促進(jìn)了環(huán)丙烷脂肪酸和不飽和脂肪酸的合成，使菌株細(xì)胞膜維持了良好的流動(dòng)性，保持了細(xì)胞膜較好的完整性，有效減輕了冷凍干燥對(duì)菌株細(xì)胞造成的損傷，因此乳酸菌的抗冷凍干燥活性得到提高。Jin 等[39]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)菌面臨低pH 值環(huán)境時(shí)，細(xì)胞壁完整性會(huì)增強(qiáng)，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。

2.5 不同初始培養(yǎng)pH 值對(duì)凍干植物乳桿菌LIP-1 細(xì)胞酶活性的影響

2 種不同初始pH 值的培養(yǎng)對(duì)冷凍干燥菌體的各種關(guān)鍵酶的酶活力有不同程度的影響，試驗(yàn)組與對(duì)照組具體結(jié)果如下。

圖5 不同初始pH 值培養(yǎng)對(duì)冷凍干燥后植物乳桿菌LIP-1 酶活力的影響Fig.5 Effects of different initial pH cultures on enzyme activity of Lactobacillus plantarum LIP-1 after freeze drying

β-半乳糖苷酶（β-GAL）是胞內(nèi)酶，與菌株的發(fā)酵速率以及細(xì)胞膜通透性相關(guān)[40]，它是反映細(xì)胞冷凍干燥損傷的關(guān)鍵酶。如圖5a 是在凍干處理后β-半乳糖苷酶泄漏到細(xì)胞膜外的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組顯著高于試驗(yàn)組，約為1.5 倍，即試驗(yàn)組胞外的β-GAL 泄漏量較少，說(shuō)明經(jīng)初始pH 6.8培養(yǎng)的LIP-1 細(xì)胞膜的完整性維持較好，這與圖4試驗(yàn)結(jié)果相一致。

乳酸脫氫酶（LDH）是乳酸菌代謝的關(guān)鍵酶，LDH 可催化丙酮酸還原為乳酸，其活力的大小可以從側(cè)面反映出菌體活力的大小。經(jīng)測(cè)定可知試驗(yàn)組活性為10.52 U，顯著大于對(duì)照組8.46 U，說(shuō)明初始pH 6.8 的培養(yǎng)維持了LDH 的活力。此外，H+-ATP 酶對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能起著極其重要的作用，本試驗(yàn)也測(cè)定了不同初始pH 值培養(yǎng)后的試驗(yàn)組與對(duì)照組ATP 酶的活力，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組與對(duì)照組相比較具有顯著性差異（P＜0.05）。試驗(yàn)組的H+-ATP 酶活性約是對(duì)照組的4.4 倍。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組菌株在低酸環(huán)境中，為響應(yīng)酸脅迫，LIP-1 保持了更高的H+-ATP 酶活性，通過(guò)消耗胞內(nèi)ATP，排出胞內(nèi)H+，更好地保持了胞內(nèi)pH值的動(dòng)態(tài)平衡從而維持細(xì)胞活性。在Matsumoto等[41]的研究中，乳酸菌在低酸環(huán)境培養(yǎng)一定時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，H+-ATP 酶活性得到提高，與本研究結(jié)果一致。此外，有研究證實(shí)菌的凍干存活和LDH 與ATP 酶活性之間存在正相關(guān)性[42]，本試驗(yàn)中試驗(yàn)組的2 種酶活性顯著高于對(duì)照組，凍干存活率也更高。

由圖5可知，經(jīng)不同初始pH 值對(duì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)冷凍干燥處理后，試驗(yàn)組的丙酮酸激酶（PK）活力0.14 U 和對(duì)照組的酶活力0.16 U 相比無(wú)顯著性差異。這說(shuō)明雖經(jīng)不同初始pH 值培養(yǎng)，但冷凍干燥后PK 的活力變化不大，可能由于PK并不是影響乳酸菌在冷凍干燥過(guò)程中損傷的關(guān)鍵代謝酶[43]，pH 的改變并未對(duì)PK 的活力有所調(diào)節(jié)。對(duì)己糖激酶（HK）活性進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組與對(duì)照組HK 活力分別為0.15，0.12 U。雖有所不同，但無(wú)顯著性差異，這一結(jié)果說(shuō)明，不同初始pH 值的培養(yǎng)對(duì)凍干菌體細(xì)胞的HK 活性影響不大。

綜上所述，經(jīng)初始pH 6.8 培養(yǎng)的LIP-1 維持細(xì)胞活性的相關(guān)酶活顯著高于經(jīng)初始pH 7.4 組。因?yàn)樵囼?yàn)組的細(xì)胞完整性更強(qiáng)，為細(xì)菌細(xì)胞抵御外界惡劣環(huán)境提供重要的保護(hù)，減少了冷凍干燥過(guò)程對(duì)植物乳桿菌LIP-1 胞內(nèi)酶的影響，因此更好地保持了細(xì)胞內(nèi)酶活性及菌體細(xì)胞的正常生理功能，從而有效提高了菌株的抗冷凍干燥活性。

3 結(jié)論

利用不同初始培養(yǎng)pH 值，在優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上對(duì)植物乳桿菌LIP-1 進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)真空冷凍干燥處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在初始pH 6.8 的培養(yǎng)條件下（試驗(yàn)組），植物乳桿菌LIP-1 的抗冷凍干燥活性更強(qiáng)。其高密度發(fā)酵活菌數(shù)為9.79 lg（CFU/mL），經(jīng)冷凍干燥后的存活率達(dá)到81.76%，與對(duì)照組相比顯著提高了9.33%。通過(guò)對(duì)比分析菌體細(xì)胞膜脂肪酸成分含量的變化可知，試驗(yàn)組細(xì)胞膜有更高的環(huán)丙烷脂肪酸含量及更高的不飽和度。同時(shí)對(duì)相關(guān)酶活性的測(cè)定表明，試驗(yàn)組與對(duì)照組的己糖激酶和丙酮酸激酶的活性并無(wú)顯著變化，但對(duì)于冷凍干燥損傷的主要代謝酶β-半乳糖苷酶、乳酸脫氫酶和ATP 酶來(lái)說(shuō)，試驗(yàn)組酶活顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

本研究表明不同初始培養(yǎng)pH 值會(huì)影響菌株的抗冷凍干燥活性。其影響機(jī)理可能是：在適宜初始培養(yǎng)pH 值條件下，植物乳桿菌LIP-1 生長(zhǎng)迅速，pH 值下降較快，菌株長(zhǎng)久處于低酸環(huán)境下，長(zhǎng)時(shí)間的酸脅迫促進(jìn)了細(xì)胞膜環(huán)丙烷脂肪酸的合成以及飽和脂肪酸向不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)化，改變了細(xì)胞膜脂肪酸的組成，使菌株細(xì)胞膜在低溫環(huán)境下保持了良好流動(dòng)性，有效減輕了冷凍干燥對(duì)菌體細(xì)胞膜造成的損傷，從而保持了細(xì)胞膜較好的完整性，減少了冷凍干燥對(duì)植物乳桿菌LIP-1 胞內(nèi)酶的影響，維護(hù)了細(xì)胞內(nèi)酶活性及菌體細(xì)胞的正常生理功能，從而有效提高了菌株的抗冷凍干燥活性。本研究可為工業(yè)生產(chǎn)中菌株的抗冷凍干燥性的提高提供一定的理論參考。