胡光富, 葉 輝, 汪 成, 單 鳴, 余燕民,陸永偉, 葉曼娜, 李雙雙, 郭紹文

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院黃浦分院, 1. 乳腺外科, 2. 病理科, 上海, 200011)

三陰性乳腺癌(TNBC)是指免疫組織化學(xué)指標(biāo)中雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人類表皮生長因子受體2(HER-2)均為陰性的一類具有高度異質(zhì)性的乳腺癌分子亞型[1]。TNBC的國際6分型[2]和復(fù)旦腫瘤4分型[3]均嘗試TNBC亞型的再分類，以實(shí)現(xiàn)對不同TNBC亞型的預(yù)后評估和精準(zhǔn)化治療。然而，目前TNBC 缺乏內(nèi)分泌治療和抗HER-2靶向治療，仍以細(xì)胞毒性化療為主要治療手段，總體治療效果不佳，易發(fā)生耐藥，患者預(yù)后較差[4]。探索針對TNBC的有效分子靶標(biāo)和研發(fā)新型靶向藥物是臨床治療TNBC的重要方向[5]。

本課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn), CD147在TNBC組織中高表達(dá)，且其高表達(dá)率與臨床病理特征、預(yù)后存在密切關(guān)系, CD147有望成為治療TNBC的新靶點(diǎn)。血小板源性生長因子CC(PDGF-CC)是PDGF-C的同源二聚體, PDGF-C通過活化為PDGF-CC而發(fā)揮作用[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn), PDGF-CC在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，其與惡性腫瘤的生長、發(fā)展密切相關(guān)。ROSWALL P等[9]報道PDGF-CC可能成為治療TNBC的新靶點(diǎn)。JASSON S等[10]發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)PDGF-CC患者的TNBC的5年遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險增高。本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測TNBC腫瘤細(xì)胞中PDGF-CC的表達(dá)，分析PDGF-CC與臨床病理特征、CD147表達(dá)的關(guān)系以及PDGF-CC、CD147對預(yù)后的影響，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

分析2009年6月—2010年6月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院黃浦分院乳腺外科(原上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院乳腺外科)手術(shù)并經(jīng)病理檢查證實(shí)為TNBC的110例患者的資料，既往石蠟標(biāo)本制作為組織芯片，并采用免疫組織化學(xué)法檢測了CD147表達(dá)水平[6]。所有患者術(shù)前均未行新輔助治療，病理類型均為非特殊類型浸潤癌，排除大汗腺癌、腺樣囊性癌、化生癌等其他類型TNBC。所有患者免疫組織化學(xué)法檢測ER、PR、HER-2均為陰性; 對于免疫組織化學(xué)法檢測HER-2為(+)或()的病例，F(xiàn)ISH檢測結(jié)果需為陰性。收集患者的患病年齡、腫瘤T分期、淋巴結(jié)N分期、病理組織學(xué)分級、免疫組織化學(xué)指標(biāo)(Ki67、CD147)等資料。

免疫組織化學(xué)檢測ER(克隆號: EP1)、PR(克隆號: PgR636)、HER-2(克隆號: 485)、Ki67(克隆號: MIB-1)的一抗均購自DAKO公司，均為單克隆即用型抗體。免疫組織化學(xué)檢測CD147的一抗購自江蘇太平洋美諾克生物藥業(yè)有限公司，為HAb18G/CD147單抗。免疫組織化學(xué)檢測PDGF-CC的一抗購自LSBIo公司(貨號LS-B11979), 為兔來源的多克隆抗小鼠PDGF-CC。生存期的定義: 從手術(shù)時間至隨訪截止時間(末次隨訪時間為2020年6月29日)，或者因乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致死亡的日期也視為截止日期。

1.2 方法

選用既往免疫組織化學(xué)法檢測過CD147表達(dá)水平的石蠟病理組織芯片。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋, 4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(H-E)染色。光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)特點(diǎn)。免疫組織化學(xué)染色采用Envision法, DAB顯色。免疫組織化學(xué)檢測PDGF-CC時，采用0.01 mol/L PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性表達(dá)的乳腺癌組織作陽性對照。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

由2位病理診斷醫(yī)生采用雙盲法分別觀察并交換判斷結(jié)果。光學(xué)顯微鏡下, PDGF-CC抗原陽性反應(yīng)位于細(xì)胞漿中，表現(xiàn)為棕黃色均勻顆粒。PDGF-CC陽性及陰性信號判斷標(biāo)準(zhǔn): 棕褐色染色細(xì)胞數(shù)≥50%判定為強(qiáng)陽性(), 25%～<50%判定為中等陽性(), <25%判定為弱陽性(+), ≤5%判定為陰性(-)。強(qiáng)陽性和中等陽性定義為高表達(dá)，弱陽性和陰性定義為低表達(dá)。以上標(biāo)準(zhǔn)均隨機(jī)選5個高倍視野(放大倍數(shù)400倍)進(jìn)行計數(shù)。CD147陽性信號判斷標(biāo)準(zhǔn)中的高表達(dá)和低表達(dá)定義與PDGF-CC相同[6]。Ki67陽性表達(dá)信號位于細(xì)胞核，棕褐色染色細(xì)胞數(shù)≥20%判定為高表達(dá)。病理組織學(xué)分級采用Scarff-Bloom-Richardson分級法，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。PDGF-CC的表達(dá)與年齡、臨床病理特征以及CD147表達(dá)水平的關(guān)系分析采用Mann-WhitneyU秩和檢驗(yàn)。單因素生存分析采用Kaplan-Meier法，差異顯著性檢驗(yàn)采用時序檢驗(yàn)(Log-rank), 生存多因素分析采用Cox比例風(fēng)險模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

110例TNBC組織中, PDGF-CC陽性表達(dá)為103例(93.64%), 其中19例(17.27%)為強(qiáng)陽性，細(xì)胞漿中出現(xiàn)彌漫且非常強(qiáng)的染色; 57例(51.82%)為中等陽性; 27例(24.54%)為弱陽性，細(xì)胞漿中有較弱的表達(dá); 7例(6.36%)為陰性，表達(dá)非常微弱或不表達(dá)。見圖1。據(jù)此統(tǒng)計, PDGF-CC高表達(dá)為76例(69.09%), 低表達(dá)為34例(30.91%)。課題組前期研究[7]結(jié)果顯示, 110例TNBC組織中CD147的強(qiáng)陽性、中等陽性、弱陽性和陰性表達(dá)分別為56例(50.91%)、22例(20.00%)、12例(10.91%)和20例(18.18%), CD147高表達(dá)為78例(70.91%), 低表達(dá)為32例(29.09%)。

A: 強(qiáng)陽性; B: 中等陽性; C: 弱陽性; D: 陰性。

2.2 TNBC中PDGF-CC的表達(dá)與年齡、臨床病理特征以及CD147表達(dá)水平的關(guān)系

PDGF-CC在TNBC組織中的表達(dá)水平與患者年齡(P=0.186)、腫瘤T分期(P=0.737)、淋巴結(jié)N分期(P=0.458)、病理組織學(xué)分級(P=0.994)和Ki67表達(dá)水平(P=0.352)均無相關(guān)性，但PDGF-CC表達(dá)水平與CD147表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(P=0.001)。見表1。

2.3 PDGF-CC、CD147在TNBC組織中表達(dá)水平與生存率的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示, PDGF-CC、CD147在TNBC組織中的不同表達(dá)水平與無病生存率(DFS)和總生存率(OS)有關(guān)。與PDGF-CC低表達(dá)組相比, PDGF-CC高表達(dá)組患者DFS和OS更低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.477、0.318); PDGF-CC和CD147均為低表達(dá)的患者DFS和OS最優(yōu)，而PDGF-CC和CD147均為高表達(dá)的患者DFS和OS最差，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.883、0.768)。見圖2。

2.4 Cox比例風(fēng)險模型分析

將110例TNBC患者年齡、腫瘤T分期、淋巴結(jié)N分期、病理組織學(xué)分級、Ki67表達(dá)、CD147表達(dá)和PDGF-CC表達(dá)進(jìn)行Cox模型多因素分析，結(jié)果顯示, PDGF-CC表達(dá)與CD147表達(dá)不是影響TNBC患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素，而患者年齡和淋巴結(jié)N分期是影響TNBC患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素。見表2。

3 討 論

TNBC是一種具有侵襲性及異質(zhì)性的乳腺癌亞型。目前, TNBC的主要治療方法仍是細(xì)胞毒性化療。聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制劑奧拉帕利(olaparib)和他拉唑帕利(talazoparib)分別于2017年和2018年由美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療包括晚期TNBC在內(nèi)的胚系BRCA1/2基因突變的轉(zhuǎn)移性乳腺癌[11]。程序性死亡配體-1(PD-L1)抑制劑阿替利珠單抗(atezolizumab)于2019年由FDA批準(zhǔn)用于治療PD-L1陽性不可切除的局部晚期或轉(zhuǎn)移性TNBC[12]。下一代測序(NGS)技術(shù)正在識別潛在的多個腫瘤分子靶點(diǎn)[13]。將TNBC的可靶向干預(yù)的基因突變及位點(diǎn)包括Akt、ERBB2、NTRK、免疫檢查點(diǎn)等應(yīng)用于臨床，為TNBC患者帶來新的轉(zhuǎn)機(jī)[14]。

表1 TNBC組織中PDGF-CC的表達(dá)與病理特征、CD147的關(guān)系

A: PDGF-CC低表達(dá)與高表達(dá)的DFS比較; B: PDGF-CC低表達(dá)與高表達(dá)的OS比較;C: PDGF-CC與CD147不同表達(dá)組合的DFS比較; D: PDGF-CC與CD147不同表達(dá)組合的OS比較。

表2 110例TNBC患者預(yù)后因素的Cox模型多因素分析

PDGF家族成員包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC、PDGF-DD, 主要分布在細(xì)胞漿中，通過激活相應(yīng)的血小板源性生長因子受體蛋白(PDGFR), 從而激活下游的酪氨酸激酶，在促進(jìn)腫瘤血管的生成、促使腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)相關(guān)基因發(fā)揮作用、誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用[15]。研究[16]表明, PDGF-CC在乳腺癌組織中的表達(dá)水平較非癌組織中的表達(dá)水平顯著升高，其在乳腺癌的生物學(xué)行為中起著非常重要的作用。研究[9]報道, PDGF-CC在TNBC細(xì)胞與CAFs間充當(dāng)“信使”角色。TNBC細(xì)胞旁分泌PDGF-CC作用于CAFs, CAFs再旁分泌多種因子反作用于TNBC細(xì)胞，使TNBC細(xì)胞衍生出不表達(dá)ER的腫瘤細(xì)胞?？贵w靶向PDGF-CC阻斷這一旁分泌機(jī)制，可使TNBC細(xì)胞衍生出高表達(dá)ER的腫瘤細(xì)胞，從而轉(zhuǎn)變?yōu)閷?nèi)分泌治療敏感的Luminal型乳腺癌。

自2014年起，本課題組就開始研究CD147在TNBC中的表達(dá)及臨床意義[17]。CD147也稱細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(EMMPRIN), 主要定位在細(xì)胞膜上。CD147是一種高度糖基化的跨膜糖蛋白，可誘導(dǎo)CAFs合成基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs), 降解基質(zhì)和基底膜而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。本課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn), TNBC標(biāo)本中CD147表達(dá)率高達(dá)85.70%, 且其表達(dá)水平可以作為獨(dú)立的預(yù)后判斷因子。

既往研究[18]發(fā)現(xiàn), PDGF-CC和CD147均可在TNBC中高表達(dá)，且兩者分別主要定位在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜上。因此，從細(xì)胞空間分布上而言，同時靶向PDGF-CC和CD147可能起到協(xié)調(diào)抑制TNBC細(xì)胞生長的作用，從而起到“雙靶聯(lián)合”效應(yīng)?；谝陨霞僭O(shè)，本研究的創(chuàng)新點(diǎn)是首次探索PDGF-CC表達(dá)與CD147表達(dá)的關(guān)系及其對預(yù)后的影響。本研究結(jié)果顯示, PDGF-CC表達(dá)與CD147表達(dá)呈正相關(guān), PDGF-CC表達(dá)和CD147表達(dá)均與患者DFS和OS有關(guān)，即兩者表達(dá)越高，患者生存率越差。本研究尚存不足，因本研究樣本量相對較小、部分患者失訪等原因，導(dǎo)致PDGF-CC表達(dá)和CD147表達(dá)對生存率的影響存在偏差，多元回歸分析也并未顯示PDGF-CC表達(dá)和CD147表達(dá)是獨(dú)立的預(yù)判斷因子。因此，未來應(yīng)該進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量及完善隨訪數(shù)據(jù)，同時開展體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，探索同時阻斷TNBC細(xì)胞的PDGF-CC和CD147靶點(diǎn)的可行性和有效性。