馬 寧，魏琳琳，刁騰月，趙 璇,2，王曉梅,3，李 可

(1.西安交通大學第二附屬醫(yī)院科研中心實驗室，陜西西安 710004；2. 商洛市中心醫(yī)院檢驗科，陜西商洛 726000；3. 漢中市洋縣人民醫(yī)院檢驗科，陜西漢中 723300)

動脈粥樣硬化是一種威脅中老年人健康的最常見的心血管疾病，是引起如心腦梗死、中風、主動脈瘤等各種急慢性心血管意外的首要病因[1]，由其引發(fā)的心腦血管病死亡是全球主要死亡原因之一。目前普遍認為動脈粥樣硬化是一種血管壁的慢性炎癥疾病[2]。動脈粥樣硬化的炎癥發(fā)病機制是一個多步驟過程[3]，其中單核/巨噬細胞發(fā)揮著重要作用[4-6]。血液單核細胞在趨化因子作用下黏附于損傷的血管內(nèi)皮細胞并侵入內(nèi)皮下聚集分化為巨噬細胞，吞噬脂蛋白分化為泡沫樣細胞并堆積形成脂質(zhì)條紋乃至脂質(zhì)斑塊[7-9]。本研究對比正常飲食對照及高脂飲食(8周和16周)誘導動脈粥樣硬化小鼠組織及全身炎癥狀態(tài)，利用紅色熒光染料PKH26標記純化的外周血單核細胞，通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，探討炎癥微環(huán)境對單核細胞向動脈粥樣硬化斑塊遷徙影響，為動態(tài)觀察動脈粥樣硬化過程中炎癥微環(huán)境狀態(tài)變化、炎癥細胞向斑塊內(nèi)遷徙提供了有效的研究方法和形態(tài)學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料油紅O染料(AMRESCO)，CCL2 ELISA試劑盒(R&D Systems)，TNF-α ELISA試劑盒(BD Biosciences)，流式抗體CD45(30-F11, APC)，CD11b(M1/70, FITC)，Ly6G(1A8, PE)，Ly6C(HK1.4, PE/Cy7)(Biolegend)，PKH26紅色熒光細胞標記試劑盒(Sigma-Aldrich)、Trizol、核酸染料SYBR Green、DAPI(Thermo Fisher Scientific)，反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(Promega)。流式細胞儀(BD Calibur, BD AriaⅡ)，實時定量PCR儀(ABI StepOne)，徠卡激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8)，徠卡冰凍切片機(LeicaCM1900)，酶標儀(Bio-tek)。

1.2 實驗動物及模型建立SPF級C57BL/6 ApoE敲除小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京) 2016-0006]，于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心[SYXK (陜) 2015-0002]SPF級環(huán)境繁育飼養(yǎng)，體質(zhì)量(20.0±2.0)g。隨機將36只雄鼠分為3組，各12只：正常飲食6周齡；高脂飲食(21%脂肪，0.15%膽固醇)8周(從6周齡開始)；高脂飲食16周小鼠，用于主動脈病理檢查及炎癥檢測[10-12]。25只小鼠用于單核細胞回輸實驗：其中高脂飲食16周小鼠(15只)隨機分為3組，各5只，用于不同量單核細胞回輸；隨機將另外10只小鼠分為2組(高脂飲食8周或16周)，各5只，用于相同量單核細胞不同周齡鼠回輸實驗。所有動物實驗經(jīng)過西安交通大學動物實驗倫理委員會批準，批件號：XJTULAC2020-16。

1.3 實驗方法

1.3.1主動脈及主動脈根部病理檢查 主動脈根部40 g/L多聚甲醛固定2 h后，200 g/L蔗糖過夜，OCT包埋，冰凍切片機5 μm連續(xù)切片。主動脈及主動脈根部切片進行油紅O染色，圖像分析軟件(Image Pro Plus, IPP)計算斑塊面積[13]。

1.3.2主動脈炎性因子及細胞mRNA表達量檢測 采用Trizol法提取主動脈RNA，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。SYBR Green染料行實時定量PCR，采用相對定量法(2-△△CT)計算mRNA相對表達量，△△CT=(CT目的基因-CTβ-actin)實驗組-(CT目的基因-CTβ-actin)對照組。以正常對照小鼠主動脈炎性因子或細胞表達水平(設為1)為對照。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，各引物序列見表1。

表1 各引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3.3ELISA檢測血漿炎性因子表達量 利用CCL2及TNF-α ELISA試劑盒，酶標儀450 nm讀取A值，根據(jù)標準品標準曲線計算待測樣本濃度。

1.3.4流式檢測外周血炎性細胞 肝素抗凝外周血，冰上裂解紅細胞后，重懸入100 μL PBS，加Fc受體阻斷抗體，冰上孵育10 min。隨后加入大鼠抗小鼠APC-CD45、FITC-CD11b、PE-Ly6G、PEcy7-Ly6C及相應同型對照抗體，冰上孵育20 min。PBS洗2遍，重懸入300 μL PBS上機檢測。FlowJo 7.6軟件分析流式細胞術結果。

1.3.5外周血單核細胞分選、標記、回輸及檢測 6～8周齡ApoE敲除雄鼠，收抗凝外周血，裂解紅細胞，封閉，利用流式抗體標記細胞，流式分選得到CD45+CD11b+ly6G-單核細胞，利用PKH26細胞染料標記紅色熒光[14]。將不同濃度的標記細胞，尾靜脈注射入動脈粥樣硬化模型小鼠體內(nèi)。24 h后收取主動脈根部，OCT包埋，5 μm冰凍切片，DAPI染色后[15]，共聚焦顯微鏡計數(shù)PKH26紅色熒光標記細胞數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0及Graph Pad Prism 7.0處理數(shù)據(jù)、作圖。計量資料用均數(shù)±標準差表示，兩組之間比較采用兩獨立樣本t檢驗或Mann-Whitney檢驗(不符合正態(tài)分布或方差不齊)；單一變量多組間比較用One-Way ANOVA分析，組間兩兩比較采用LSD法進行分析。P<0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 高脂飲食8周和16周ApoE敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊的對比本研究利用高脂飲食誘導動脈粥樣硬化模型。為比較高脂飲食8周和16周ApoE敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊，整條主動脈和主動脈根部切片進行脂質(zhì)油紅O染色，以正常飲食6周齡小鼠作為陰性對照。高脂飲食16周小鼠較高脂飲食8周小鼠主動脈斑塊明顯增多(t=6.276，P<0.001，圖1A、圖1C)，主動脈根部斑塊亦明顯增多(Z=-2.882，P<0.01，圖1B、圖1D)。結果提示，高脂飲食時間延長，ApoE敲除小鼠動脈粥樣硬化病變加重。

圖1 高脂飲食8周和16周ApoE敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊的比較

2.2 高脂飲食8周和16周ApoE敲除小鼠組織炎癥變化為檢測小鼠主動脈組織局部炎癥變化，利用實時定量PCR檢測相關炎癥/趨化因子及細胞含量。以正常飲食6周齡小鼠相應mRNA相對表達平均值為1，高脂飲食16周小鼠主動脈炎癥/趨化因子CCL2(Z=-2.882,P<0.01)、TNF-α(Z=-2.722,P<0.01)、IL-1β(Z=-2.882,P<0.01)相對表達量均較高脂飲食8周小鼠明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(表2，圖2A)。高脂飲食16周小鼠主動脈巨噬細胞相對表達量(9.86±0.74)明顯高于高脂飲食8周小鼠(4.93±0.38)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=5.914，P<0.001，圖2B)。提示高脂飲食16周小鼠主動脈組織巨噬細胞增多，局部炎性反應加重。

表2 高脂飲食小鼠主動脈相關促炎因子mRNA水平Tab.2 mRNA levels of proinflammatory cytokines on high-fat diet(n=6)

2.3 高脂飲食8周和16周ApoE敲除小鼠全身炎癥變化ELISA檢測血漿炎癥/趨化因子結果顯示：隨高脂飲食時間延長，血漿炎癥/趨化因子CCL2、TNF-α含量顯著升高(P<0.001，圖3A)。流式分析外周血免疫細胞測定，細胞分群策略見圖3B。隨高脂飲食時間延長，小鼠外周血粒細胞、單核/巨噬細胞及炎性單核/巨噬細胞亞群逐漸增多(P<0.05或P<0.01，圖3C)，單核/巨噬細胞受體CCR2平均熒光強度逐漸增高(P<0.01，圖3D)。提示高脂飲食16周小鼠全身炎性反應加重。

圖2 高脂飲食16周小鼠組織炎癥反應加重

圖3 高脂飲食16周小鼠全身炎癥反應加重

2.4 PKH26標記單核細胞主動脈根部遷徙比較PKH26標記單核細胞分為3組，2×105/100 μL、5×105/100 μL、1×106/100 μL尾靜脈輸入高脂飲食16周ApoE敲除小鼠體內(nèi)。24 h后，各組主動脈根部斑塊內(nèi)紅色熒光陽性單核細胞數(shù)量分別為：6.40±1.36、16.80±2.27和34.20±4.53，組間比較具有統(tǒng)計學差異(F=21.49，P<0.001，圖4A、圖4B)。2×105/100 μL組即可檢測到遷徙細胞，隨回輸細胞數(shù)量增多，斑塊內(nèi)遷徙細胞增多。為觀察炎癥微環(huán)境對單核細胞向斑塊內(nèi)遷徙影響，2×105/100 μL標記單核細胞尾靜脈注射入高脂飲食8周和16周ApoE敲除小鼠。結果發(fā)現(xiàn)，高脂飲食16周小鼠主動脈根部斑塊中遷徙細胞個數(shù)(7.20±1.02)明顯多于高脂飲食8周小鼠(1.80±0.37)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=4.971,P<0.01，圖4C、圖4D)。

圖4 尾靜脈注射PKH26標記單核細胞主動脈根部遷徙的比較

3 討 論

盡管在治療方面取得了重大進展，但動脈粥樣硬化的臨床后遺癥、心臟病發(fā)作和中風仍是目前的主要死亡原因。ROSS課題組[16]在1986年首次明確提出動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，是對損傷的一種過度防御反應。目前普遍認為，動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病[2,17]。動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展涉及到動脈內(nèi)膜中多種細胞的活化[18]，從而導致局部炎癥反應。

巨噬細胞是AS斑塊內(nèi)的重要炎癥細胞，對微環(huán)境炎癥狀態(tài)發(fā)揮重要影響作用，參與動脈粥樣硬化疾病進展各個階段[19-20]。本研究利用流式分選技術，分選外周血單核細胞，體外標記紅色熒光染料PKH26，通過細胞回輸, 原位展現(xiàn)外周血單核細胞進入斑塊并進行定量分析。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著回輸細胞增多，斑塊內(nèi)遷徙細胞增多。因小鼠循環(huán)血量少，每只小鼠大約僅能獲得1 mL全血，獲取外周血單核細胞總量低，2×105可作為首選尾靜脈注射細胞量，此細胞量較為經(jīng)濟。另外，實驗發(fā)現(xiàn)，隨高脂飲食時間延長，ApoE敲除小鼠動脈粥樣硬化病變加重，組織及全身炎性反應加重，其炎癥微環(huán)境有助于外周血單核細胞向動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)遷徙。

研究證實，PKH26可用于多種細胞染色，其不可逆地結合細胞膜脂質(zhì)雙層，假陽性率低。其毒性較小，只要標記濃度適當，基本不會對細胞生物學特征產(chǎn)生影響，并且可以在體內(nèi)保留長達1年[14]。本研究在動脈粥樣硬化小鼠模型中成功建立了PKH26標記單核細胞體內(nèi)遷徙示蹤模型。此方法可應用于其他免疫細胞或?qū)嵸|(zhì)細胞體外分選及體內(nèi)示蹤，也可應用于不同標記或攜帶不同基因修飾的細胞治療和作用研究。