于建設(shè)，劉森

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

1 血膽紅素來源

正常代謝途徑中，膽紅素主要來自于被巨噬細(xì)胞吞噬的衰老紅細(xì)胞，紅細(xì)胞被吞噬后在組織蛋白酶的作用下形成血紅素，血紅素又在血紅素加氧酶系的作用下生成膽綠素，膽綠素在膽綠素還原酶的催化下，由NADPH 提供H 還原成膽紅素。血中的膽紅素以膽紅素-清蛋白復(fù)合體的形式進(jìn)行運輸，在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)與葡萄糖酸醛結(jié)合形成可溶于水且能迅速與重氮試劑迅速反應(yīng)的結(jié)合膽紅素(CB)。而未與葡萄糖酸醛結(jié)合的非結(jié)合膽紅素(UCB)是具有毒性的脂溶性物質(zhì)，易透過細(xì)胞膜對細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器造成傷害[2,3]。

2 血膽紅素聚集部位

膽紅素的神經(jīng)系統(tǒng)毒性在人類大腦區(qū)域選擇性的，人類尸體解剖和岡大鼠的病理研究顯示，其主要聚集區(qū)域有大腦皮層、中腦、腦干核、基底節(jié)、海馬和小腦存在特殊的異常。受影響的腦干核有聽覺核(耳蝸核、上橄欖核、梯形體核、外側(cè)丘核、下丘核)、動眼神經(jīng)核、前庭核。與運動控制相關(guān)的主要受影響的是基底節(jié)區(qū)的GP 和STN 以及小腦浦肯野細(xì)胞[6]。同時分化程度較低的神經(jīng)元細(xì)胞對膽紅素更敏感。在某種程度上，少突膠質(zhì)細(xì)胞很容易受到膽紅素反射的影響，這是在神經(jīng)元中觀察到的結(jié)果。此外，少突膠質(zhì)細(xì)胞的髓鞘堿性蛋白生成減少，從而導(dǎo)致髓鞘形成和神經(jīng)元軸突功能受損。很少有研究利用有機型腦培養(yǎng)來研究膽紅素毒性，特別是海馬切片，顯示膽紅素破壞突觸可塑性，而小膠質(zhì)細(xì)胞在UCB 誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中起關(guān)鍵作用[8]。另外，當(dāng)血清/血漿膽紅素(TB)水平超過嬰兒的神經(jīng)保護(hù)防御時，不僅上述神經(jīng)系統(tǒng)受累，同時還會由腦干影響呼吸、神經(jīng)體液和電解質(zhì)的平衡[9]。有臨床研究者進(jìn)一步認(rèn)為，聽覺通路對膽紅素?fù)p傷的敏感性高于基底神經(jīng)節(jié)，尤其是早產(chǎn)兒。其研究發(fā)現(xiàn)對膽紅素?fù)p傷的區(qū)域易損性排序如下：小腦＞聽覺通路＞基底神經(jīng)節(jié)[11]。

3 血膽紅素升高后引起的癥狀

克尼特氏癥為一遺傳性的膽血紅素代謝疾病，因肝臟葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glycuronosyltransferase)缺乏，從而引起高膽紅素血癥。多從嬰幼兒時期開始發(fā)病，如不進(jìn)行治療則會進(jìn)一步發(fā)展為核黃疸(kernicterus)。其主要臨床表現(xiàn)為：(1)運動和運動調(diào)節(jié)異常的運動系統(tǒng)障礙；(2)聽神經(jīng)病譜系障礙(ANSD)伴或不伴聽力喪失的聽覺癥狀；(3)動眼神經(jīng)運動障礙；(4)乳牙牙釉質(zhì)發(fā)育不良。運動張力異常為肌張力異常，同時伴有運動遲緩或者舞蹈病的手足搐搦癥，步態(tài)異常。肌張力障礙傳統(tǒng)上被認(rèn)為與基底神經(jīng)節(jié)神經(jīng)回路的功能障礙有關(guān)。然而，最近的證據(jù)表明，運動障礙可能取決于位于大腦皮層(GP)和丘腦下核(STN)的基底神經(jīng)節(jié)的病變，而不是僅僅一個運動系統(tǒng)的孤立功能障礙。運動和聽覺癥狀從輕微到嚴(yán)重不等。牙釉質(zhì)發(fā)育不良的表現(xiàn)多種多樣。除非有額外的神經(jīng)損傷，否則認(rèn)知功能一般是完好無損的[6]。

但如果膽紅素累及小腦并且引起小腦損傷的患兒，有可能出現(xiàn)膽紅素誘導(dǎo)的神經(jīng)功能障礙(BIND)，患兒除上述癥狀外還可表現(xiàn)出認(rèn)知障礙、注意力缺陷和社會情感障礙等精神癥狀[11]。

4 血膽紅素造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機制

未結(jié)合白蛋白的高水平膽紅素(UCB)是具有神經(jīng)毒性的。較低范圍的非結(jié)合膽紅素可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而中高水平的膽紅素則導(dǎo)致神經(jīng)元壞死?，F(xiàn)階段所提出的膽紅素誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的機制包括膽紅素脂溶性損傷細(xì)胞膜、影響信號傳導(dǎo)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂、細(xì)胞內(nèi)線粒體能量耗竭、促細(xì)胞炎癥因子的釋放和細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的紊亂等理論。

4.1 血膽紅素的脂溶性

人體內(nèi)膽紅素的主要同分異構(gòu)體是膽紅素- ixα(Z,Z)，雖然這是一種親水親脂分子(兩親分子)，但它對細(xì)胞膜脂質(zhì)有很高的親和力。同時有研究表明，細(xì)胞膜是膽紅素毒性的主要或初始靶點。然而在生理條件和相關(guān)研究條件下，不同濃度膽紅素與細(xì)胞膜產(chǎn)生的復(fù)合物的實際性質(zhì)，以及問什么膽紅素對不同組織細(xì)胞有不同的親和力，這兩方面的試驗及理論信息都很少。Zucker 和同事的實驗表明：膽紅素的兩親性促進(jìn)了與磷脂雙分子層的相互作用，并將作用位點定位于細(xì)胞膜膜-水界面附近的極性區(qū)域。同時膽紅素對磷脂不對稱的破壞，對膜結(jié)合ATP 酶的抑制，脂質(zhì)過氧化，和其他不良的后遺癥可能隨之而來。在這方面，Ly 和同事最近分享了初步的發(fā)現(xiàn)，脂筏(是質(zhì)膜上富含膽固醇和鞘磷脂的微結(jié)構(gòu)域(microdomain)。大小約70nm 左右，是一種動態(tài)結(jié)構(gòu)，位于質(zhì)膜的外小頁。)微域可能是膽紅素中毒的一個靶點[10]。

4.2 血膽紅素影響信號傳導(dǎo)通路

在大鼠海馬切片中，膽紅素降低了大鼠海馬區(qū)興奮性突觸后電位，顯著增加了海馬區(qū)中大多數(shù)細(xì)胞高峰的潛伏期，從而降低了突觸的激活。膽紅素可增強大鼠外上橄欖核分離神經(jīng)元的抑制性突觸傳遞，在離體的大鼠耳蝸腹側(cè)核神經(jīng)元中，通過Ca2+依賴性機制增加聽覺小鼠神經(jīng)元發(fā)育過程中γ-氨基丁酸/甘氨酸的釋放[4]。

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)UCB 的慢性毒性涉及谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白GLAST、Glt1、EAAC1、vGluT1 和vGluT2.[18]星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中谷氨酸轉(zhuǎn)運障礙導(dǎo)致細(xì)胞外谷氨酸增加，導(dǎo)致神經(jīng)元N -甲基D -天冬氨酸(NMDA)的NR1，NR2A 和NR2B 亞基顯著減少，谷氨酸受體(NMDA)在神經(jīng)損傷的發(fā)病機制中起重要作用。一旦NMDA 通道被打開，細(xì)胞內(nèi)鈣增加，產(chǎn)生自由基，神經(jīng)元壞死或凋亡[10][12]。

同時膽紅素濃度升高還可激活體內(nèi)外Nrf2 介導(dǎo)的通路，Nrf2 是抵御外源性刺激物和有毒物質(zhì)的核心因子，以引起抗氧化反應(yīng)應(yīng)答，氧化損傷被廣泛認(rèn)為是膽紅素引起細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡的機制。同時多種細(xì)胞抑制蛋白、蛋白激酶介導(dǎo)的磷酸化、以及細(xì)胞核的抑制因子均與其有關(guān)[8][14]。

4.3 血膽紅素引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂

除了Ca2+的儲存和參與信號傳遞外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的一個關(guān)鍵功能是對新合成的膜和分泌蛋白進(jìn)行折疊和加工。如果這些功能發(fā)生了損傷或者障礙，就會導(dǎo)致一種被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的病理狀態(tài)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞檢測和清除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白的過程。錯誤折疊的蛋白通過IRE1、PERK 和ATF6 檢測，并增加BiP 和DNAJB9 等伴侶蛋白的表達(dá)，以幫助蛋白折疊。當(dāng)這些措施失敗時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過誘導(dǎo)CHOP 和caspase 的激活而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。雖然UCB 主要積累在神經(jīng)系統(tǒng)的組織細(xì)胞內(nèi)，但有學(xué)者已經(jīng)證明，UCB 只在神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而不在星形膠質(zhì)細(xì)胞中誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[15][21]。

細(xì)胞內(nèi)膽紅素沉積引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一個證據(jù)來自于基礎(chǔ)實驗室的一項實驗，研究人員進(jìn)行SH-SY5Y 神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析并與cMap 數(shù)據(jù)庫中包含的其他化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生的基因表達(dá)模式進(jìn)行比較。通過檢測其中最“相似”的化學(xué)物質(zhì)是thapsigargin，它通過抑制維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高鈣濃度的SERCA ATPase 蛋白而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[21]。

同時少突膠質(zhì)細(xì)胞前體和肝癌細(xì)胞系的研究也顯示，膽紅素通過增加關(guān)鍵因子如GPR78、IRE1、ATF3 和CHOP 等來引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。雖然在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的初始階段，細(xì)胞會激活生存機制，例如未折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)，但當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲備耗盡時，未折疊蛋白反應(yīng)(protein response, UPR)被激活，如果這個反應(yīng)延時過于長，則會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。毒性水平的膽紅素能抑制神經(jīng)元細(xì)胞蛋白酶體的降解，使未折疊蛋白的積累和促凋亡通路的激活。抑制CHOP或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路可增加細(xì)胞存活，這與在體內(nèi)對Ugt1-/-FVB/NJ 小鼠小腦的研究一致，這說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因素(ATF3、Fas 和CHOP)在嚴(yán)重新生兒高膽紅素血癥的初始階段含量顯著增加，并在隨后持續(xù)存在[8]。

4.4 細(xì)胞內(nèi)線粒體功能異常

膽紅素對線粒體的影響主要是氧化磷酸化的破壞，導(dǎo)致能量產(chǎn)生減少，線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C 釋放到細(xì)胞漿中，通過與凋亡蛋白酶激活因子1 結(jié)合，激活caspases，導(dǎo)致凋亡神經(jīng)元死亡。同時膽紅素通過改變了神經(jīng)元和星形細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)從而增加膜流動性，促進(jìn)磷脂酰絲氨酸的外化外傳單，導(dǎo)致吞噬識別和細(xì)胞死亡。通過這種機制，膽紅素也會破壞線粒體膜，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，并且細(xì)胞內(nèi)氧自由基數(shù)量增加，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4][12]。

4.5 促細(xì)胞炎癥因子的釋放

促炎細(xì)胞因子，如TNF-a、IL-1b 和一氧化氮(NO)也被認(rèn)為是神經(jīng)元凋亡的介質(zhì)。UCB 通過核因子kappa B (NF-jB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑(例如p38 和p38 和p38)增加星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的TNF-a、IL-1b 和IL-6 的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。同時膽紅素抑制神經(jīng)生長因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)的生存前信號的激活，例如與PC12 神經(jīng)元樣細(xì)胞系和大鼠原代CGN 培養(yǎng)物中Akt 蛋白激酶B 系統(tǒng)有關(guān)的信號。在未成熟大鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)中，膽紅素不僅激活caspase-3，還激活caspase-8 和caspase-9，從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元功能障礙。在人體中由于UCB 誘導(dǎo)的NF-jB 活化具有細(xì)胞年齡依賴性，未成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出更多的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致更多的細(xì)胞因子分泌。這種情況可以解釋為什么早產(chǎn)兒對UCB 腦病更敏感[4][5][13][19]。

4.6 細(xì)胞內(nèi)Ca2+紊亂

有學(xué)者實驗發(fā)現(xiàn)UCB 對神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+具有動態(tài)且強烈的直接干擾，而膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)保持不變。說明神經(jīng)元細(xì)胞受到UCB 的靶向攻擊。進(jìn)行進(jìn)一步實驗證明UCB 造成細(xì)胞Ca2+紊亂主要的攻擊靶點為神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而不是線粒體。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為動態(tài)Ca2+存儲的功能，與胞漿相比具有非常高的Ca2+水平，并且由此造成的Ca2+波動與細(xì)胞外Ca2+濃度無關(guān)。一旦細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，將會引起一系列胞內(nèi)與Ca2+相關(guān)的生化反應(yīng)。鈣蛋白酶是Ca2+依賴的半胱氨酸蛋白酶家族，已被證明在Caspase-12 的激活中發(fā)揮作用，細(xì)胞質(zhì)Ca2+水平的升高導(dǎo)致鈣蛋白酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的積累和激活，在那里它可以激活Caspase-12 開啟凋亡程序。同時Ca2+水平的升高還會通過第二信使途徑激活蛋白酶、脂肪酶和核酸內(nèi)切酶，并觸發(fā)自由基的產(chǎn)生，這些事件最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡[10][15]。

5 膽紅素的抗氧化作用

膽紅素作為血紅素分解代謝的最終產(chǎn)物，長期以來一直被認(rèn)為是一種具有潛在毒性的廢物，直到1987 年才被確認(rèn)為可能具有生理重要性的抗氧化劑。生理范圍內(nèi)的膽紅素(包括游離膽紅素、白蛋白結(jié)合膽紅素、結(jié)合膽紅素和未結(jié)合膽紅素)不僅能清除活性氧，還能清除過氧亞硝酸鹽等RNS。有學(xué)者就以上發(fā)現(xiàn)提出了一個假設(shè)，即膽紅素可能通過增加NO 釋放并激活NO 相關(guān)的細(xì)胞保護(hù)信號。同時其基礎(chǔ)研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)能夠通過多種機制調(diào)節(jié)免疫功能：①抑制抗原特異性和多克隆T 細(xì)胞反應(yīng)，②抑制CD4 + T 細(xì)胞反應(yīng)性，③增加B 細(xì)胞數(shù)量，④腹膜巨噬細(xì)胞上Fc 受體的過表達(dá)，⑤抑制人粒細(xì)胞的趨化活性，⑥抑制蛋白激酶C，⑦降低晚期糖基化終產(chǎn)物生成水平[1][3][4][17]。

血紅素加氧酶(heme oxygenase, HO)是血紅素分解代謝過程中的限速酶，HO 有三種類型，其中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的主要是HO-1，同時HO-1 也被認(rèn)為是紅細(xì)胞衰老過程中細(xì)胞對氧化應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志物。但有研究顯示HO-1 其作用不僅僅是抗氧化和抗炎活性，在小鼠體內(nèi)促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放的作用已得到證實。但HO-1 不適時、持續(xù)或過度激活可能引起Nrf2 的激活導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16-23]。

6 小結(jié)

血膽紅素對神經(jīng)系統(tǒng)的影響及對神經(jīng)元的損傷不是以上幾種現(xiàn)有理論單獨作用的結(jié)果，而是多種因素，多種環(huán)節(jié)，相互作用，相互影響的結(jié)果。膽紅素通過其脂溶性聚集在細(xì)胞膜、線粒體膜以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，通過影響多種胞膜通道以及細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，造成細(xì)胞線粒體能量供給失衡，胞內(nèi)離子紊亂，進(jìn)而引發(fā)炎癥因子的大量釋放，誘導(dǎo)凋亡程序的開啟，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡或死亡。另一方面生理濃度下的膽紅素有很好的抗氧化及清除自由基的作用，在一定基礎(chǔ)上保護(hù)組織細(xì)胞。合理運用膽紅素?fù)p傷細(xì)胞及保護(hù)細(xì)胞的機制，可預(yù)防多種疾病，因此，我們需要進(jìn)一步研究并完善相關(guān)理論基礎(chǔ)，給予臨床工作更多指導(dǎo)。