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        細胞DNA Feulgen快速染色方法

        2021-04-01 14:14:50賀海云朱紅霞
        世界最新醫(yī)學信息文摘 2021年17期
        關鍵詞:分析方法

        賀海云,朱紅霞

        (新疆克孜勒蘇柯爾自治州克州人民醫(yī)院病理科,新疆 阿圖什 845350)

        0 引言

        近年來,惡性腫瘤的發(fā)病率呈上升趨勢。惡性腫瘤已成為一個重要的死亡原因。中國癌癥死亡總人數(shù)占全球的近1/4[1]。癌癥對我國乃至世界的公共衛(wèi)生服務提出了更高的要求,因此惡性腫瘤的早期篩查、診斷和治療顯得尤為重要。

        目前,惡性腫瘤的篩查方法主要基于細胞病理學方法。但這種方法受各病理學家診斷水平的影響,主觀性強,不可避免地會導致一些誤診和漏診。隨著現(xiàn)代分子病理檢測技術的發(fā)展,DNA 定量細胞病理倍體分析得到廣泛應用,為惡性腫瘤的早期診斷和篩選提供了重要的檢測手段。DNA的標準染色方法是Feulgen 染色法,而DNA 核圖像定量分析是一種相對客觀、可控的新的病理診斷技術,能較早地反映惡性腫瘤細胞的生長情況。大量研究表明,細胞核DNA 圖像分析對惡性腫瘤的早期診斷、治療和預后具有重要的指導意義[2]。Feulgen 染色是Feulgen 和Rossenbeck于1924 年發(fā)現(xiàn)的一種核內DNA 染色技術。Feulgen 染色已成為DNA 圖像定量分析的標準[3]。然而,現(xiàn)有的經(jīng)典Feulgen 染色法耗時較長,耗時長達4 小時。建立了一種快速Feulgen 染色方法,并與經(jīng)典Feulgen 染色法進行了比較。這種快速Feulgen 染色方法可用于圖像分析系統(tǒng)中細胞核DNA 含量和倍性的測量與分析??蓾M足臨床快速病理診斷的要求。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        從我院婦科門診部采集宮頸癌標本100 例,進行宮頸癌篩查和檢測。每個樣品均采用液基法制備,隨機分為經(jīng)典組和快速組,分別染色。經(jīng)典組用常規(guī)標準程序染色4 小時,快速組用快速Feulgen 法染色30 分鐘。

        1.2 試劑與儀器

        1.2.1 BS 固定溶液配置

        測量甲醇160mL(80%)、甲醛30mL(15%)和冰醋酸10mL(5%),混合后放入儲瓶中儲存。60%磷酸:將120mL(60%)磷酸和80mL(40%)蒸餾水混合。DNA 染色液(廈門麥克奧迪有限公司提供)按60%磷酸和蒸餾水的比例配制。向細胞DNA 染色液中加入196mL 蒸餾水,加入0.2g 硫堇和0.2g 偏亞硫酸鹽,在棕色試劑瓶中磁力攪拌4mL60%磷酸,于使用當天制備。染液在35℃恒溫箱中攪拌過濾60 分鐘。過濾后立即密封染料溶液,并將其儲存在培養(yǎng)箱中臨時儲存。染料溶液應為藍紫色。梯度乙醇(50%、75%、95%乙醇各一缸,無水乙醇兩缸)。

        1.2.2 儀器

        Motic DNA 圖像分析系統(tǒng)、液基制片機,DNA 染色機(麥克奧迪集團有限公司),生化培養(yǎng)箱。

        1.3 方法

        二組染色均由DNA 染色機染色。

        1.3.1 經(jīng)典Feulgen 染色法的標準組步驟如下

        (1)用BS 固定液固定50 分鐘(25℃);(2)用自來水沖洗; (3)用60%磷酸水解60 分鐘(25℃);(4)用自來水沖洗;(5)硫堇染色60 分鐘(25℃);(6)后用自來水沖洗,蒸餾水洗滌15 分鐘(25℃);(7)用梯度乙醇脫水,過二甲苯,滴中性膠封;(8)掃描和圖像分析。

        1.3.2 快速Feulgen 染色法

        首先將快速Feulgen 染色固定液、60%磷酸、染色液和蒸餾水預先預熱到60℃。(1) 在BS 固定液中固定5 分鐘(60℃); (2)用自來水沖洗;(3)用60%磷酸酸水解10 分鐘(60℃);(4)用自來水沖洗;(5)在DNA 染色液中染色10 分鐘(60℃);(6)用自來水沖洗,然后用水浸泡1 分鐘;(7) 脫水:用梯度乙醇、對二甲苯和中性膠脫水;(8) 所有的Feulgen 染色片均采用麥克奧迪醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司的全自動細胞圖像分析系統(tǒng)進行掃描分析。

        1.4 統(tǒng)計學分析

        用SPSS 19.0 統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析,并檢驗兩組的一致性。計算兩種方法測得的IOD 和CV 的95%置信區(qū)間。

        2 結果

        2.1 在顯微鏡下用兩種染色圖像分析方法檢測效果,細胞輪廓清晰,細胞核染色深,背景干凈。見圖1。

        圖 1 經(jīng)典 Feulgen 染色法 快速 Feulgen 染色法

        2.2 二兩種染色方法對宮頸標本二倍體細胞核IOD 和CV 值一致性的影響,用麥克奧迪實業(yè)有限公司提供的Moticymeter進行掃描,并用Classify 分析系統(tǒng)對每組常規(guī)標本和每組標本的直方圖和散點圖(圖2)進行分析。測量宮頸標本細胞核的積分光密度(IOD),計算二倍體細胞核的平均IOD 值,以IOD 平均值作為二倍體細胞核DNA 含量的代表值。DNA 含量差異用CV 表示。CV=標準偏差/平均值×100%,由系統(tǒng)自動生成。

        2.3 兩種染色方法對IOD 和CV 值一致性的影響100 例宮頸標本經(jīng)典染色法IOD 值平均值為116.314,快速染色法為115.257,兩者比較接近。一致性檢驗結果表明,兩種染色方法的IOD 一致性較好。經(jīng)典染色法的CV 值為8.263,快速染色法的CV 值為7.849。一致性檢驗結果表明,兩種染色方法的CV 值一致,如表1 所示,表明快速Feulgen 染色法具有較高的重復性。

        表1 種染色法所得100 例宮頸標本二倍體細胞核IOD、CV 值情況

        3 討論

        Feulgen 染色已廣泛應用于DNA 圖像分析系統(tǒng)所測細胞核的定量分析[4],根據(jù)DNA 染色的機理,F(xiàn)eulgen 染色仍然是DNA 圖像分析系統(tǒng)中的標準染色方法之一,而酸化水解在染色反應中起著非常重要的作用,其原理是細胞DNA 酸化水解后,脫氧核糖和嘌呤之間的糖苷鍵斷裂。脫氧核糖的末端與醛接觸,與染色液中硫堇和亞硫酸鹽的中間產物結合,形成藍紫色化合物??焖貴eulgen 染色法采用高濃度磷酸高溫酸化水解法,顯色結果呈藍色,使DNA 染色效果也達到檢測標準,克服了經(jīng)典Feulgen 染色時間長達4 小時,縮短到25 分鐘的缺點,從而大大提高了DNA 染色的質量為DNA 含量分析在快速病理診斷中的應用和推廣提供幫助。為了在一般實驗條件下達到快速Feulgen 染色的目的,我們發(fā)現(xiàn)在60℃恒溫下,用磷酸水解宮頸涂片10 分鐘,DNA 硫堇染色液染色10 分鐘。結果表明,細胞核染色較深,結構清晰,背景較淺,但染色時間由1 小時縮短到10 分鐘。這種快速Feulgen 染色對實驗條件要求不高,通用培養(yǎng)箱能滿足要求。此外,磷酸溶液試劑可重復使用3-4 次,預熱時注意密封可重復使用15-20 次。但染色液不能重復使用,只能當天配制使用。染色液的使用過程中還存在以下問題:配制時要避光;攪拌、過濾、染色盡量在同一溫度下進行;否則,溶解染料會因溫度變化而沉淀,導致結晶,影響染色。

        圖2 同一標本各組染色直方圖及散點圖對比

        在常規(guī)宮頸涂片、冰凍切片、組織印跡和快速石蠟切片的快速病理診斷過程中,當僅憑病理組織和細胞形態(tài)難以判斷腫瘤是良惡性時,細胞DNA 含量和倍體分析可提供重要參考,這已經(jīng)被許多腫瘤研究所證實。病變細胞核DNA含量和DNA 倍體類型的測定,可以顯示病變細胞的增殖活性,有助于良惡性腫瘤的鑒別[5,6]。細胞核倍體的測定與分析對判斷腫瘤惡性程度、選擇治療方案、預測預后具有重要價值[7],從而進一步擴大細胞DNA 檢測的應用范圍。快速Feulgen 染色法與經(jīng)典Feulgen 染色法檢測細胞DNA 結果高度一致。因此,快速Feulgen 染色法在臨床疾病輔助診斷中具有時間短、穩(wěn)定性好、工作效率高等優(yōu)點,值得推廣應用。

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