裴艷志，聶美楠，姜騰蛟，王曉強，李春磊，路 通，朱曉峰，鄒志田(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院心胸外科，黑龍江 佳木斯 154003)

腫瘤表面自分泌趨化因子受體7(CCR7)高表達與腫瘤自身分泌的配體次級淋巴組織趨化因子(SLC)或T細胞分泌的配體結(jié)合后可趨化腫瘤向淋巴結(jié)方向轉(zhuǎn)移[1]。CCR7異常表達見于宮頸癌、大腸癌、前列腺癌、胰腺癌、食管鱗癌等多種腫瘤細胞，并且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。研究[3]顯示SLC、CCR7在促進腫瘤淋巴結(jié)特異性轉(zhuǎn)移方面可能發(fā)揮著重要作用，SLC、CCR7可能參與促進非小細胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程。本研究擬證明SLC及其受體CCR7與I期非小細胞肺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移及TNM分期具有相關(guān)性，并可能參與非小細胞肺癌淋巴管的生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的調(diào)控。為預(yù)測I期非小細胞肺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移提供臨床指標(biāo)，為非小細胞肺癌的靶向治療提供靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院胸外科2010-01-01～2015-01-01共60例行肺癌根治的I期NSCLC患者標(biāo)本，作為病例組。納入標(biāo)準：(1)經(jīng)過影像學(xué)及病理學(xué)檢查而確診[4]；(2)均進行肺癌根治的I期NSCLC患者；(3)腫瘤直徑<3cm；(4)包括肺癌組織、肺門(N1)淋巴結(jié)、隆突下(N2)淋巴結(jié)；腺癌，鱗癌。排除標(biāo)準：(1)伴有呼吸道及肺部感染，以及胸腔積液的患者；(2)心血管疾病及其他病史的患者；(3)神志不清的患者。同時收集10例肺良性病變患者正常肺組織(對照組1)及20例肺良性病變患者淋巴結(jié)組織(對照組2)作為對照組。所有患者知情并愿意參加本研究，經(jīng)本院倫理委員會同意并簽訂知情同意書。3組患者的一般資料無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組對象的一般資料比較

1.2 方法

1.2.1應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測各組織中SLC及CCR7的表達

嚴格按照SLC及CCR7試劑盒(江蘇雨桐生物科技有限公司提供)的說明書進行操作，具體步驟如下[5]：采集肺癌組織、肺良性病變患者的正常肺組織及淋巴結(jié)組織并進行常規(guī)的石蠟包埋，制作石蠟切片后并放于67℃烘箱中進行烘片2h，直到脫蠟至無水，并用pH7.4的PBS沖洗3次，然后進行切片的煮沸清洗。每張切片加入1滴的3%的雙氧水，在室溫的環(huán)境下進行孵育10min，并以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，然后PBS沖洗3次，每次沖洗3min，并在顯微鏡下觀察5min。最后進行蘇木素復(fù)染，采用0.1%的鹽酸分化，并用自來水進行沖洗，藍化處理，得到切片經(jīng)過梯度酒精的脫水并干燥，二甲苯洗脫到透明，使用中性樹膠進行封固，晾干后觀察。高倍鏡下選取9 個視野計數(shù)細胞，每張切片選擇5個高倍鏡視野(400×)，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進行定量灰度掃描后進行分析。根據(jù)陽性細胞數(shù)占同類細胞數(shù)的百分比評分：<25%為1 分，25%～50% 為2 分，51%～75%為3 分，>75% 為4 分。取兩項評分的乘積作為總積分，>5 分為陽性。

1.2.2RT-PCR檢測SLCmRNA及CCR7mRNA表達

得到的肺癌組織、肺良性病變患者正常肺組織及肺良性病變患者淋巴結(jié)組織進行磨碎，首先在200μLPCR管中配制25μL反應(yīng)體系，然后在94℃溫度下預(yù)變性5min，再變性1min；52℃退火1min；72℃延伸1min，按照變性、退火、延伸步驟進行PCR擴增35次，最后72℃延伸10min。然后進行PCR相對基因表達分析，在所有PCR所檢測的的基因中，以RPL32為內(nèi)參基因，按照2-ΔΔCT 方法[6]，以正常大白兔來源的組織RNA為對照，來計算相對基因表達。首先制備電泳膠，然后按照操作說明將制備好的電泳膠放入電泳槽，同時將PCR產(chǎn)物倒入，加入緩沖液，樣本混勻后放入電泳膠孔。PCR反應(yīng)條件[7]：取5 μLPCR的產(chǎn)物，加點在紙上，然后使用6×上樣緩沖液，反復(fù)吸打使其混勻，然后進行電泳，100V下電泳20～30min，并在紫外燈下進行觀察，結(jié)果進行掃描保存。并計算SLC mRNA及CCR7mRNA的表達量。

1.2.3 相關(guān)性分析

收集患者的性別、年齡、淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移、腫瘤大小和分化程度等資料，分析SLC及CCR7的表達與性別、年齡、淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移、腫瘤大小和分化程度等的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3組肺組織的SLC及CCR7表達

病例組與兩組對照組的SLC、CCR7的表達陽性率，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組肺組織的SLC及CCR7表達的陽性率[n(%)]

2.2 3組肺組織的SLC mRNA及CCR7mRNA表達

病例組的SLC mRNA及CCR7mRNA的表達量明顯高于兩組對照組，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組肺組織的SLC mRNA及CCR7mRNA表達

2.3 SLC及CCR7表達與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移關(guān)系

SLC及其受體CCR7的表達與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；但是SLC及其受體CCR7的表達與患者的性別、年齡、腫瘤大小和分化程度無關(guān)(P>0.05)。見表4。

表4 SLC及CCR7表達與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移關(guān)系

3 討論

肺癌的微轉(zhuǎn)移是指肺癌在發(fā)生、發(fā)展的過程中一種表現(xiàn)，產(chǎn)生的腫瘤細胞會存活于淋巴結(jié)、血液循環(huán)、骨髓以及各種組織器官中，還沒有形成顯性的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，也不會在轉(zhuǎn)移部位出現(xiàn)任何臨床表現(xiàn)，使用常規(guī)檢查方法如影像學(xué)和臨床病理學(xué)等均難以發(fā)現(xiàn)的一種微量轉(zhuǎn)移[8]。雖然現(xiàn)階段的肺癌分期系統(tǒng)能夠較好地提示患者的預(yù)后情況，但對于I期的患者，其預(yù)后情況卻不盡相同。這種結(jié)果是否患者在術(shù)前出現(xiàn)了隱匿性腫瘤微轉(zhuǎn)移[9]。大量的研究證實，當(dāng)腫瘤的直徑<3cm可能會出現(xiàn)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，進而導(dǎo)致預(yù)后結(jié)果較差的原因[10]，也可能是較早的發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的重要因素[11]。

SLC是屬于CC類的趨化因子，SLC是由活化的T淋巴細胞和內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，在高內(nèi)皮小靜脈和淋巴結(jié)T細胞區(qū)的高表達[12]。CCR7是SLC的高親合力的受體，主要存在于幼稚T細胞、B細胞和樹突狀細胞表面[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)SLC在腫瘤常見轉(zhuǎn)移部位呈現(xiàn)高水平表達，顯示SLC與CCR7共同參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲。SLC-CCR7生物學(xué)在細胞的轉(zhuǎn)移方面有一定的作用，并且可以調(diào)控其它趨化因子的分泌[15]。但是關(guān)于I期非小細胞肺癌SLC及其受體CCR7的表達與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移關(guān)系未見報道，因此本研究具有一定創(chuàng)新性。

本研究的結(jié)果顯示肺癌組織中的SLC及其受體CCR7的表達均比肺良性病變患者正常肺組織及肺良性病變患者淋巴結(jié)組織高，而且相關(guān)分析認為SLC及其受體CCR7表達與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移有關(guān)；與患者的性別、年齡、腫瘤大小和分化程度無關(guān)。這也說明了SLC及其受體CCR7表達在I期非小細胞肺癌中存在高表達，而且這種表達與I期非小細胞肺癌的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移。

理論上手術(shù)后進行輔助治療對控制腫瘤細胞的亞臨床轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的患者具有一定意義，但是篩選高危人群進行合理治療對患者的作用比較大。而I期非小細胞肺癌SLC及其受體CCR7的表達情況可以為此類患者進行判斷，從而確定該進行治療的患者，這對盲目的接受治療更有意義，這也正是本次研究的意義的重要性。

綜上所述，I期非小細胞肺癌SLC及其受體CCR7的表達為高表達，這種表達與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移有關(guān)。