郭潤發(fā)，張立新，朱文凱，周延?xùn)|，毛 靜，葛紅山

（泰州市人民醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科，江蘇 泰州 225300）

蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot）是一種通過SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨特異性蛋白的方法，被廣泛用于檢測基因表達(dá)產(chǎn)物或比較表達(dá)產(chǎn)物量的相對變化，獲得高品質(zhì)的蛋白樣本是保證其結(jié)果準(zhǔn)確的前提條件。目前提取蛋白所用的裂解液種類繁多，裂解時(shí)間、裂解方法等均會(huì)影響蛋白的提取效果，應(yīng)用于后續(xù)的Western blot 檢測時(shí)效果具有較大的差異[1]。目前實(shí)驗(yàn)室最常用組織細(xì)胞裂解液是經(jīng)典的RIPA 裂解液，然而研究發(fā)現(xiàn)使用RIPA buffer 提取精子蛋白并不理想[2,3]，精子細(xì)胞是一種高度分化的細(xì)胞，精子的結(jié)構(gòu)和功能都有別于其他體細(xì)胞，在其細(xì)胞內(nèi)外存在著多種糖蛋白或糖復(fù)合物，它們參與精卵識別、粘附、結(jié)合以及質(zhì)膜融合等受精活動(dòng)，在受精過程中起著非常重要的作用[4]。但是由于精子蛋白在結(jié)構(gòu)上的多型性、功能上的復(fù)雜性而且其表達(dá)量相對其他體細(xì)胞較低，選用恰當(dāng)?shù)牧呀夥椒ㄓ行崛【拥鞍资莻€(gè)亟待解決的實(shí)驗(yàn)問題。

1 材料與方法

1.1 材料Percoll 硅膠顆粒混懸液（Solarbio）；SDS 裂解液、RIPA（強(qiáng)）裂解液、蛋白酶抑制劑（PMSF）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、BeyoBlue?考馬斯亮藍(lán)超快染色液（碧云天)；β-actin 抗體、LonP1 抗體（Abcam）； 二抗anti-rabbit （中杉金橋）、蛋白marker 26616（Thermo）；一抗稀釋液（杭州弗德生物有限公司），其他常用試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 精子的采集及保存在經(jīng)患者同意的前提下，選取我中心就診的男性患者，年齡位于25～35歲之間，液化正常、濃度約50×106/ml、活動(dòng)率約50%，畸形率正常的100 份男性精子標(biāo)本。精液經(jīng)室溫30min液化后，將精液加到含有40%Percoll 分離液的離心管中,1500 rpm 離心15 min,收集底部沉淀并重懸于2 ml 精子洗滌液中1500 rpm離心10 min,棄上清液，將沉淀凍于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 精子總蛋白提取和濃度測定

1.2.2.1 不同裂解液對總蛋白提取的影響。將解凍后精子混勻計(jì)數(shù)，分6組，每組取100×106個(gè)精子分別加入100ul 的RIPA（強(qiáng)）或含有1%、2%、3%、6%、10%SDS 濃度的SDS 裂解液中，加入PMSF，震蕩并室溫裂解15 分鐘后，12000rpm 離心10min 收集上清液，選用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.2.2 不同裂解時(shí)間對總蛋白提取的影響。將解凍后精子混勻計(jì)數(shù)，分3組，每組取100×106個(gè)精子分別加入100ul 含有1%SDS 濃度的SDS 裂解液中，加入PMSF，震蕩并室溫分別裂解5min、15min、25min 后，12000rpm 離心10min 收集上清液，選用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.2.3 不同裂解方法對總蛋白提取的影響。將解凍后精子混勻計(jì)數(shù)，分3組，每組取100×106個(gè)精子分別加入100ul 的含有1%SDS 濃度的SDS 裂解液中，加入PMSF，震蕩并裂解15分鐘后，組1直接12000rpm 離心10min 離心收集上清液；組2使用超聲破碎儀冰上100 W超聲4s間隔30s，重復(fù)5 次后離心收集上清液；組3 在超聲后100℃煮沸10min，然后離心收集上清液，分別用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.2.4 不同細(xì)胞量對總蛋白提取的影響。將解凍后精子混勻計(jì)數(shù)，分3 組，分別取100×106個(gè)、200×106個(gè)、500×106個(gè)精子分別加入100ul 含有1%SDS濃度的SDS裂解液中，加入PMSF，室溫裂解15min 后，12000rpm 離心10min 收集上清液，選用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.3 考馬斯亮藍(lán)染色分析 配制分離膠濃度8%，濃縮膠濃度5%SDS-PAGE 凝膠，取30mg 總蛋白上樣，并使用羊水細(xì)胞作為陽性對照，與marker 同時(shí)120V 電泳；電泳至距膠底部停止電泳。取下凝膠，加入染色液染色60min 后，加入適量去離子水，在搖床上搖動(dòng)脫色。每隔約10～30min，更換新的去離子水，更換3次后，繼續(xù)在搖床上脫色過夜。

1.2.4 Western Blot 分析 配制分離膠濃度8%，濃縮膠濃度5% SDS-PAGE 凝膠，取40mg 總蛋白上樣，與marker同時(shí)120V電泳；分離蛋白后半干轉(zhuǎn)膜，隨后將膜置于5%牛奶封閉破中室溫孵育2 h；LonP1、β-actin 抗體（Abcam）（1 : 2000）4 ℃過夜孵育；TBST 緩沖液充分洗膜，二抗anti-rabbit（1:4000)室溫孵育2 h。TBST 緩沖液充分洗膜后ECL高敏感化學(xué)發(fā)光試劑顯色，掃描圖片并拍照。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示，若滿足正態(tài)分布及方差齊性的條件，多組間比較采用單因素方差分析，多組間中的兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)，若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同裂解液對總蛋白提取的影響比較6 組不同裂解液發(fā)現(xiàn)，通過SDS 裂解液處理獲得的總蛋白含量明顯高于RIPA組（P＜0.05），但不同SDS濃度裂解液獲得的總蛋白濃度并無顯著差異（P＞0.05），見表1。

表1 不同裂解液對總蛋白提取的影響

2.2 不同裂解時(shí)間對總蛋白提取的影響比較3組不同處理時(shí)間發(fā)現(xiàn)，處理時(shí)間延長總蛋白濃度并無顯著差異（P＞0.05），見表2。

表2 不同裂解時(shí)間對總蛋白提取的影響

2.3 不同裂解方法對總蛋白提取的影響比較3組不同方法發(fā)現(xiàn)，超聲后高位煮沸提取的總蛋白濃度最高，顯著高于震蕩組（P＜0.05），見表3。

表3 不同裂解方法對總蛋白提取的影響

2.4 不同細(xì)胞濃度對總蛋白提取的影響比較3組不同細(xì)胞濃度裂解結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞濃度越高獲得的總蛋白量越高（P＜0.05），見表4。

表4 不同細(xì)胞濃度對總蛋白提取的影響

2.5 SDS-PAGE電泳結(jié)果電泳后的凝膠，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)超快染色液染色后，結(jié)果顯示不同處理方法之間蛋白條帶的數(shù)量差異不明顯，但1%SDS裂解液震蕩處理15min 在蛋白強(qiáng)度上要優(yōu)于其他各組。通過使用羊水細(xì)胞作為陽性對照發(fā)現(xiàn)，精子細(xì)胞在蛋白表達(dá)豐度上都低于體細(xì)胞，見圖1。

2.6 Western blot 結(jié)果利用β-actin 和LonP1 抗體檢測通過在SDS裂解液中超聲后煮沸提取的精子蛋白，β-actin和LonP1條帶均能清晰表達(dá)，見圖2。

圖1 SDS-PAGE電泳結(jié)果

圖2 Western blot結(jié)果

3 討論

精子是一種不同于其它組織和細(xì)胞的生殖細(xì)胞，在生命的繁衍過程中精子細(xì)胞承擔(dān)著特殊的使命，為了完成其生理功能，精子細(xì)胞的結(jié)構(gòu)具有特異性，使其具有較強(qiáng)的韌性和抗酸堿能力，這無疑對于精子蛋白的提取構(gòu)成了很大的困難，如何高效地獲得高質(zhì)量的精子總蛋白是研究精子與卵子的相互作用過程、分子機(jī)制的基礎(chǔ)[5]。

本實(shí)驗(yàn)通過比較不同的裂解方法，尋找適合的精子細(xì)胞蛋白提取的裂解條件，以期為后續(xù)精子相關(guān)研究提供合適的蛋白提取和免疫印跡方法。研究結(jié)果顯示，SDS 裂解液的裂解效率高于RIPA裂解液（P＜0.05），原因可能是RIPA裂解液中SDS含量過低，僅為0.1%。而精子膜結(jié)構(gòu)較為特殊，SDS 裂解液中富含高濃度的SDS 能有效的破壞精子的磷脂雙分子層，使其解離釋放膜中的蛋白。但細(xì)胞的裂解和蛋白完整性的破壞是一對矛盾，采用強(qiáng)效的表面活性劑在提高細(xì)胞裂解效率的同時(shí)也增加了蛋白完整性破壞的概率。實(shí)驗(yàn)證明使用更高的SDS 濃度并不能有效增加獲得的總蛋白濃度。因此，此次實(shí)驗(yàn)中最適合作為精子提蛋白的裂解液是1%SDS濃度的SDS裂解液。

為驗(yàn)證裂解時(shí)間對精子蛋白提取的影響，采用5min、15min、25min 裂解時(shí)間，比較發(fā)現(xiàn)并無顯著性差異。除了改變裂解液，本實(shí)驗(yàn)還研究了通過物理手段提高裂解效率，發(fā)現(xiàn)通過超聲后煮沸可顯著提高精子的總蛋白的濃度（P＜0.05），原因可能是高溫可以迅速使細(xì)胞裂解，充分釋放蛋白，并能滅活蛋白酶，使總蛋白濃度提高。最后本實(shí)驗(yàn)研究了精子數(shù)目對總蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)由于精子細(xì)胞是一種特化的細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)特殊，所攜帶蛋白量較少，使用盡可能多的精子數(shù)量進(jìn)行蛋白的提取可以有效提高總蛋白含量，SDS-PAGE 和Western blot電泳結(jié)果顯示，通過超聲后煮沸的精子總蛋白在作為實(shí)驗(yàn)材料驗(yàn)證目的蛋白上并無差異，可用于Western blot 分析。綜上所述，我們認(rèn)為精子蛋白提取時(shí)應(yīng)使用1%SDS裂解液，在盡可能短時(shí)間進(jìn)行超聲后煮沸，可以提取到最大限度的高濃度、高質(zhì)量的精子蛋白，這無疑為后續(xù)研究精卵作用機(jī)制、受精機(jī)理的最終探明奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。