姚 娜，黃燕明，汪 靜，李雪銀，陳桂生，王 斌，康志英，3

(1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.寧夏隆德縣六盤山中藥資源開發(fā)有限公司，寧夏 固原 756300；3.廣東香雪南藥發(fā)展有限公司，廣東 肇慶 526642)

麩炒白術(shù)為白術(shù)飲片經(jīng)蜜炙麩皮炮制加工制成。白術(shù)為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，冬季下部葉枯黃、上部葉變脆時采挖，除去泥沙，烘干或曬干，再除去須根，即得。白術(shù)具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，臨床上多用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動不安的治療[1-2]。白術(shù)經(jīng)麩炒后，健脾消食作用得以增強[3]。目前，麩炒白術(shù)藥理活性的研究主要圍繞抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、利尿、調(diào)節(jié)腸胃功能以及抑制腫瘤細胞等方面展開[4]。麩炒白術(shù)主要含有揮發(fā)油、白術(shù)多糖、內(nèi)酯類、氨基酸、微量元素和蒲公英萜醇乙酸酯等成分，其中揮發(fā)油、白術(shù)多糖和內(nèi)酯類是麩炒白術(shù)的主要有效成分[5-8]。雖然已有文獻[9]對麩炒白術(shù)配方顆粒的特征圖譜進行研究并確定了8個特征峰，但是未對其特征峰進行指認。因此，本文采用HPLC法建立了麩炒白術(shù)指紋圖譜，確立了12個共有峰，并采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)對8個共有峰進行指認，從整體上評價其工藝和質(zhì)量，以提高麩炒白術(shù)配方顆粒的質(zhì)量評價水平。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290型超高效液相色譜(UPLC)，連接6530型四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀(Q-TOF-MS)，配有兩個獨立二元泵、可控溫自動進樣器、可控溫柱溫箱、二極管陣列檢測器(DAD)和電噴霧離子源(ESI)；LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；MS204TS萬分之一電子分析天平(瑞士Mettler toledo公司)；KQ500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

白術(shù)對照藥材(批號：120925-201611)，購自中國食品藥品檢定研究院；咖啡酸(批號：110885-200102)，購自中國食品藥品檢定研究院；異綠原酸A(批號：151028)、異綠原酸B(批號：150327)、異綠原酸C(批號：150724)均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；乙腈(天津賽孚瑞公司，色譜級)；甲酸(天津市光復精細化工廠，分析純)；甲醇(北京化工廠，分析純)；乙酸乙酯(北京化工廠，分析純)；水為娃哈哈純凈水。

1.3 樣品

共收集18批白術(shù)飲片，其中安徽亳州6批，浙江東陽3批，浙江磐安2批，河北安國3批，湖南龍山2批，河南溫縣2批。樣品經(jīng)廣州市香雪制藥股份有限公司高級工程師康志英鑒定為真品。參照2015年版《中國藥典》麩炒白術(shù)炮制方法將18批白術(shù)飲片炮制成麩炒白術(shù)飲片，由本實驗室根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求(征求意見稿)》，研究麩炒白術(shù)配方顆粒的制備工藝，并按照確定的制備工藝制成18批中試批量的麩炒白術(shù)配方顆粒。

2 方法與結(jié)果

2.1 麩炒白術(shù)配方顆粒指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Waters Symmetry?-C18色譜柱(柱長為250 cm，柱內(nèi)徑為4.6 mm，粒徑為5 μm)；以乙腈為流動相A，以0.5%甲酸水溶液為流動相B，進行梯度洗脫；檢測波長為313 nm，洗脫條件見表1。

2.1.2 參照物溶液制備 取白術(shù)對照藥材約1.0 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加水25 mL，煎煮30 min，放冷，濾過，用乙酸乙酯萃取4次，每次25 mL，收集乙酸乙酯部分，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

表1 梯度洗脫條件

2.1.3 供試品溶液制備 取本品約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加水25 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)使溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次25 mL，收集乙酸乙酯部分，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 指紋圖譜方法學考察

2.2.1 專屬性試驗 取麩炒白術(shù)配方顆粒，按照“2.1.3”項下供試品溶液的方法制備，按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果12個共有色譜峰均不受溶劑因素干擾，專屬性良好。

2.2.2 精密度試驗 取上述麩炒白術(shù)配方顆粒樣品，按色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，每次10 μL，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版)》進行評價，相似度均大于0.90，表明該儀器的精密度良好。

2.2.3 重復性試驗 取同一批麩炒白術(shù)配方顆粒樣品，平行6份，按照“2.1.3”項下供試品溶液的方法制備，依法測定，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版)》進行評價，相似度均大于0.90，表明該分析方法重復性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，按色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、24、48 h進樣分析，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版)》進行評價，相似度均大于0.90，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 指紋圖譜的構(gòu)建

取18批麩炒白術(shù)配方顆粒，按供試品溶液制備方法和色譜條件測定，得到18批麩炒白術(shù)配方顆粒的色譜疊加圖(見圖1)。根據(jù)相對保留時間穩(wěn)定及各批次樣品均能檢出的原則，選擇了12個特征峰作為共有峰。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版)》進行評價，結(jié)果相似度均大于0.90。

2.4 共有峰的指認

通過質(zhì)譜檢測對麩炒白術(shù)配方顆粒指紋圖譜中的共有峰進行指認。

2.4.1 供試品溶液制備 同“2.1.3”項下方法制備供試品溶液。

2.4.2 色譜條件 色譜分離采用Agilent Eclipse Plus C18UPLC色譜柱(100 mm×3.0 mm，1.8 μm)，配有在線過濾器。柱溫：40 ℃，流速：0.5 mL/min，流動相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～3 min (5% B)，3～5 min (5%～10% B)，5～10 min (10%～15% B)，10～13 min (15%～24% B)，13～17 min (24%～30% B)，17～20 min (30%～35% B)，20～23 min (35%～41% B)，23～27 min (41% B)，27～28 min (41%～100% B)，28～32 min (100% B)，后運行時間10 min。檢測波長：313 nm，每次進樣：3 μL。

圖1 18批麩炒白術(shù)配方顆粒HPLC疊加

2.4.3 質(zhì)譜條件 分別在正、負離子模式下進行，干燥氣溫度325 ℃，干燥氣流速6 L/min，霧化氣壓力45 psi，毛細管電壓3 500 V(正模式)和3 000 V(負模式)，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速12 L/min。一級質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍50～1 100m/z。二級質(zhì)譜選用Target-MS/MS模式，碰撞電壓10和30 eV。所得LC-MS數(shù)據(jù)由Agilent MassHunter軟件采集。

2.4.4 質(zhì)譜分析 精密吸取麩炒白術(shù)配方顆粒供試品溶液注入LC-MS儀，按上述條件進行檢測，根據(jù)麩炒白術(shù)配方顆粒供試液的UPLC-UV色譜圖和UPLC-TOF-MS總離子流圖(正、負模式)，圖中標識的1～16號色譜峰物質(zhì)，均得到了良好的分離和檢測(見圖2)。

通過高分辨TOF-MS的精確質(zhì)量數(shù)測定，對上圖中1-16號峰物質(zhì)進行了鑒定，結(jié)合在正模式下生成[M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+等加合離子，和負模式下生成 [M-H]-加合離子的情況，推斷出化合物的精確分子量和分子式，結(jié)果見表2。

表2 麩炒白術(shù)配方顆粒UPLC-Q-TOF-MS分析

續(xù)表2

通過質(zhì)譜檢測結(jié)果結(jié)合參考文獻比對分析，共推斷出13個色譜峰的化學結(jié)構(gòu)。由于液質(zhì)聯(lián)用儀的液相部分為UPLC，其色譜圖與HPLC的色譜行為有些差異。通過對照品比對4個已知成分咖啡酸、異綠原酸A、B、C，分析結(jié)果與質(zhì)譜結(jié)果一致。12個HPLC共有峰中指認了其中8個已知成分。質(zhì)譜分析結(jié)果與共有峰指認結(jié)果對應關(guān)系見表3。

2.4.4 對照圖譜的建立 取18批麩炒白術(shù)配方顆粒，按供試品溶液制備方法和色譜條件測定，通過質(zhì)譜檢測和對照品比對，生成的對照指紋圖譜見圖3。

表3 質(zhì)譜分析結(jié)果與共有峰指認結(jié)果對應關(guān)系

峰1：對羥基苯甲酸；峰2：咖啡酸；峰5：東莨菪內(nèi)酯；峰6：異綠原酸B ；峰7：異綠原酸A ；峰8：異綠原酸C ；峰9：刺五加酮；峰10：洋薊素

3 討論

采用光電二極管陣列檢測器考察麩炒白術(shù)配方顆粒供試品溶液在不同波長下色譜圖情況。供試品溶液在190～400 nm波長下進行掃描，通過3D視圖和等吸收圖譜進行分析，結(jié)果顯示在250～330 nm波長范圍內(nèi)，基線平穩(wěn)，信息量較大。選取其中常見波長進行分析，313 nm下各色譜峰響應值適中，分離度良好，故最終確定以313 nm為檢測波長。

供試品提取溶媒考察對比了水提取與乙酸乙酯萃取的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)乙酸乙酯萃取富集后，色譜圖中信息量較大，故采用乙酸乙酯萃取的方法制備樣品。

考慮到指紋圖譜多成分、整體質(zhì)量控制，選擇白術(shù)對照藥材作為隨行對照，為與顆粒提取工藝保持基本一致，將白術(shù)對照藥材進行水煎煮。結(jié)果對照藥材與顆粒色譜峰基本一致，故選擇白術(shù)對照藥材作為麩炒白術(shù)配方顆粒指紋圖譜的參照物。

經(jīng)與對照品比對，在25.585 min的色譜峰為咖啡酸的色譜峰，在44.497 min的色譜峰為異綠原酸B的色譜峰，在45.128 min的色譜峰為異綠原酸A的色譜峰，在46.935 min的色譜峰為異綠原酸C色譜峰，其中峰9響應穩(wěn)定，達到基線分離，故選擇峰9作為對照品參照峰，并將其標記為峰S。

本文采用HPLC建立了麩炒白術(shù)配方顆粒指紋圖譜，對其相似度進行評估，采用UPLC-Q-TOF-MS分析技術(shù)指認了8個共有峰，分別為對羥基苯甲酸、咖啡酸、東莨菪內(nèi)酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、刺五加酮、洋薊素，可為麩炒白術(shù)配方顆粒的大批量生產(chǎn)質(zhì)量標準建立及全過程質(zhì)量監(jiān)控提供參考。