王 哲 王升厚 柳葉飛 王 澤 趙洪新 趙曉云 徐方旭

（1.沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110034；2.沈陽(yáng)師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧沈陽(yáng) 110034；3.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江杭州 310018；4.沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110016）

野生蛹蟲(chóng)草主要分布在我國(guó)的東北地區(qū)及河北、廣西等省區(qū)，遼寧省在1986年便發(fā)現(xiàn)蛹蟲(chóng)草[1]，其化學(xué)成分和藥理作用與冬蟲(chóng)夏草相近，是冬蟲(chóng)夏草的最理想替代品[2]。近年來(lái)，蛹蟲(chóng)草經(jīng)過(guò)人工馴化培育，技術(shù)手段趨向成熟，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。沈陽(yáng)市是我國(guó)最早人工栽培蛹蟲(chóng)草的地區(qū)[3]，經(jīng)分析證實(shí)，人工培育的蛹蟲(chóng)子實(shí)體中含有豐富的：蟲(chóng)草素、腺苷等活性物質(zhì)，蟲(chóng)草素作為一種核苷類似物，有著廣泛的生物學(xué)功能，不僅可以作為抗癌的藥物[4]，還對(duì)治療白血病有顯著功效[5]，目前開(kāi)發(fā)前景廣闊[6]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料供試菌種的編號(hào)為C02，是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中篩選出來(lái)的菌種之一，由沈陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。培養(yǎng)基分為3種，即母種培養(yǎng)基、液體菌種培養(yǎng)基和栽培種培養(yǎng)基。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 母種制作 （1）將新鮮無(wú)芽無(wú)病變的馬鈴薯去皮，切成0.3～0.8 cm的條狀，加水煮汁，約10 min后，煮至熟而不爛狀，用8層紗布進(jìn)行過(guò)濾。

（2）將濾液定容后加入瓊脂粉攪拌均勻，再加入葡萄糖、磷酸二氫鉀、無(wú)水硫酸鎂、維生素B1等，加熱煮沸，分裝到試管中。

（3）在121℃的環(huán)境中，高壓滅菌25 min，滅菌結(jié)束溫度降至80℃以下，趁熱取出試管擺斜面，培養(yǎng)基稍低于試管的2/3處即可（切勿沾到棉塞，防止雜菌滋生），冷卻凝固后備用。

（4）接種，將 10種編號(hào)為 C01、C02、C03、C04、C05、C06、C07、C08、C09、C10的母種分別繼代，用無(wú)菌接種鏟在母種最前端取黃豆粒大小，接種到新的培養(yǎng)基上，在20℃的環(huán)境中避光黑暗培養(yǎng)，空氣濕度控制在65%左右，10d后見(jiàn)自然光，共培養(yǎng)15 d，觀察其長(zhǎng)勢(shì)及轉(zhuǎn)色情況。

1.2.2 液體菌制作 （1）將玉米粉充分溶于水后，再加熱煮沸。

（2）定容后，加入葡萄糖、磷酸二氫鉀、無(wú)水硫酸鎂，蛋白胨、維生素B1碾碎煮沸，攪拌均勻后分裝到250 mL的三角瓶中，裝液量占三角瓶的1/3～1/2，迅速封口。

（3）裝入立式高壓滅菌鍋中，在123℃的環(huán)境中滅菌40 min，冷卻后備用。

（4）接種，將剩余8種編號(hào)為C02、C03、C05、C06、C07、C08、C09和C10的母種進(jìn)行液體種接種，在超凈工作臺(tái)上將母種試管取0.5 m3大小的菌塊，接種于液體培養(yǎng)基中，溫度控制在21℃，搖床頻率120 r/min，培養(yǎng)6 d，觀察菌球生長(zhǎng)速度及菌球是否均勻一致。5

1.2.3 瓶載培養(yǎng)基制作 （1）將14種雜糧（燕麥、小米、高粱米、玉米、糙米、黃豆、蕎麥、薏米、綠豆、紅豆、黑豆、黑米、大米和小麥），分別裝入750 mL的罐頭瓶中，每瓶35 g。

（2）按常見(jiàn)小麥培養(yǎng)基的料水比1∶1.6加清水，即56 mL/瓶，封口。

（3）水平裝入立式高壓滅菌鍋中，在123℃的環(huán)境中滅菌2 h，待冷卻后備用。

（4）在超凈工作臺(tái)上接種，取8種液體菌種，用無(wú)菌水將菌種稀釋，稀釋倍數(shù)為1∶5，每瓶接種稀釋液5 mL。

1.2.4 出草管理 （1）出草室消毒。發(fā)菌前，對(duì)出菇室進(jìn)行消毒。1 m3空間用15 mL的40%甲醛加入14 g高錳酸鉀消毒45 min，開(kāi)窗通風(fēng)24 h后可進(jìn)入發(fā)菌。

（2）發(fā)菌溫度保持在18℃，當(dāng)菌種萌發(fā)后升至20℃，將空氣相對(duì)濕度控制在60%左右，避光黑暗培養(yǎng)7 d。

（3）當(dāng)菌絲長(zhǎng)滿料面、穿透底面近2/3后，見(jiàn)光培養(yǎng)，每天光照18～20 h，白天散射自然光，夜晚采用日光燈補(bǔ)充光照。溫度控制在20℃，空氣濕度控制在80%，每天通風(fēng)0.5 h。當(dāng)原基出現(xiàn)后，將瓶口塑料膜封口膜扎眼通氧，加強(qiáng)瓶?jī)?nèi)外氣體交換，溫度保持在22℃，待草芽長(zhǎng)出3～4 cm后補(bǔ)充水分，空氣濕度調(diào)為85%，每天通風(fēng)2～3次，每次30～50 min，連續(xù)培養(yǎng)60 d左右，觀察子實(shí)體的長(zhǎng)勢(shì)及商品性。收獲后，將其在55℃的恒溫箱中干燥至恒重，干重稱重，并計(jì)算生物轉(zhuǎn)化率。

1.2.5 優(yōu)化料水比 當(dāng)料水比為1∶1.6時(shí)，觀察14種碳源的發(fā)菌情況、轉(zhuǎn)色情況、原基形成情況等，觀察結(jié)束后記錄其長(zhǎng)勢(shì)情況，并對(duì)不適宜的料水比進(jìn)行調(diào)整，直至調(diào)整到適宜蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)為止。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)菌轉(zhuǎn)色結(jié)果由圖1可知，培養(yǎng)基F發(fā)菌比較緩慢，見(jiàn)光后邊緣輕微轉(zhuǎn)色，料面中心內(nèi)不發(fā)菌；培養(yǎng)基I和培養(yǎng)基J不轉(zhuǎn)色；培養(yǎng)基K僅邊緣發(fā)菌，見(jiàn)光轉(zhuǎn)色不均勻，菌絲不吃料。圖2發(fā)菌均勻，見(jiàn)光轉(zhuǎn)色快，菌絲吃料。

圖1 未發(fā)菌及發(fā)菌不轉(zhuǎn)色的碳源培養(yǎng)基

圖2 發(fā)菌及轉(zhuǎn)色正常的碳源培養(yǎng)基

2.2 料水比優(yōu)化栽培試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)多次栽培，觀察發(fā)菌、轉(zhuǎn)色及原基情況，根據(jù)實(shí)際情況調(diào)節(jié)料水比，得到表1。

表1 料水比調(diào)節(jié)表

由表1可知，第一批料水比為1∶1.6，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基F、I、J、K未發(fā)菌或發(fā)菌少，故直接淘汰，其他除培養(yǎng)基D水分偏少外，其余水分都偏多；根據(jù)第一批栽培結(jié)果進(jìn)行料水比調(diào)整，直至得到最適料水比。通過(guò)圖3可知，菌絲要平鋪料面，無(wú)氣生菌絲及厚菌皮，培養(yǎng)基不能太干燥，發(fā)菌后不能露出雜糧顆粒等。

圖3 優(yōu)化料水比后發(fā)菌情況

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)得到適宜的料水比：A為1∶1.4，B為1∶1.1，C為1∶1.4，D為1∶1.7，E為1∶1.1，G為1∶1.4，H為1∶1.6，L為1∶1.1，M為1∶1.1，CK為1∶1.6。研究結(jié)果能夠?yàn)橄x(chóng)草產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。