朱臻怡，魏云計(jì)，何正和

［淮安海關(guān)，國(guó)家飼料安全檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（淮安），江蘇淮安 223001］

激素類藥物是指以人體或動(dòng)物激素（包括與激素結(jié)構(gòu)、作用原理相同的有機(jī)物）為有效成分的藥物。飼料是動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中重要投入品之一，為改善動(dòng)物生產(chǎn)性能、提高畜產(chǎn)品產(chǎn)量，激素被用作動(dòng)物飼料添加劑或埋植于動(dòng)物皮下，以促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，使畜牧業(yè)在初期得到迅猛發(fā)展。在利益驅(qū)動(dòng)下，一些養(yǎng)殖業(yè)違規(guī)使用或?yàn)E用激素類藥物，一些藥物會(huì)引起動(dòng)物自身生理特征變化，還會(huì)殘留蓄積在動(dòng)物組織里，通過(guò)食物鏈或環(huán)境釋放進(jìn)入人體。動(dòng)物源性食品的激素類藥物殘留已經(jīng)成為了目前國(guó)內(nèi)外食品安全的熱點(diǎn)問(wèn)題［1］，它會(huì)影響人體內(nèi)的正常激素功能，擾亂激素平衡，導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂，甚至影響人體的生理活動(dòng)，造成對(duì)人類生殖和發(fā)育的負(fù)面影響，具有致癌作用和干擾神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)等嚴(yán)重危害［2］?！帮暳习踩扔谑称钒踩钡挠^念已形成世界范圍的共識(shí)，保證食品安全應(yīng)從源頭抓起，控制和禁止激素在養(yǎng)殖業(yè)中的使用已引起各方面的關(guān)注，中國(guó)及美國(guó)、歐盟等國(guó)家已相繼頒布一系列法律，禁止在飼料中使用激素類藥物或?qū)ζ涮砑恿考右韵拗疲?］。飼料是各種畜禽動(dòng)物外源性激素的主要來(lái)源，因此檢測(cè)飼料中激素類藥物具有重要意義。目前針對(duì)飼料中激素的檢測(cè)主要有化學(xué)方法、生物學(xué)方法等，由于激素類藥物種類繁多且飼料基質(zhì)相對(duì)復(fù)雜，選擇適當(dāng)高效的檢測(cè)手段同樣重要。

筆者就飼料中常見的激素類藥物種類、使用情況、健康危害及其檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為飼料和食品行業(yè)及檢測(cè)人員，在掌控飼料和食品中激素類藥物殘留信息，以及采用適合的檢測(cè)技術(shù)方面提供參考。

1 飼料中激素類藥物的使用狀況及其危害

1.1 飼料中激素類藥物的分類及使用狀況

激素的種類繁多，來(lái)源復(fù)雜，按化學(xué)性質(zhì)可分為兩大類：（1）含氮激素，主要包括肽類和蛋白質(zhì)激素及胺類激素等；（2）類固醇（甾體）激素，主要是腎上腺皮質(zhì)和性腺分泌的激素。按化學(xué)結(jié)構(gòu)大致分為4類：（1）典型如腎上腺皮質(zhì)激素、性激素等的類固醇；（2）包括甲狀腺素、腎上腺髓質(zhì)激素、松果體激素等的氨基酸衍生物；（3）結(jié)構(gòu)為肽與蛋白質(zhì)的垂體激素、胰島素、胃腸激素等；（4）脂肪酸衍生物，如前列腺素。通常飼料中激素類藥物按藥物類別劃分，大致有5 類：腎上腺皮質(zhì)激素類、性激素類、甲狀腺激素類、胰島素類和垂體前葉激素類。性激素和生長(zhǎng)激素是畜牧生產(chǎn)中常用的激素類藥物，其中性激素根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)和來(lái)源分為內(nèi)源性激素、人工合成類固醇激素和人工合成的非類固醇激素3 類。

合理的使用激素添加劑可以適當(dāng)提高畜禽生產(chǎn)性能，而濫用激素添加劑則會(huì)造成其在動(dòng)物源性食品中殘留，進(jìn)而危害人類健康，激素類藥物殘留還會(huì)影響我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的長(zhǎng)足發(fā)展國(guó)際市場(chǎng)進(jìn)程。因此必須采取有效措施減少和控制激素類藥物殘留的發(fā)生。我國(guó)政府一直把健全飼料法律法規(guī)、禁止在飼料中濫用激素等作為保證養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展、維護(hù)人類健康的一項(xiàng)重要措施［4］。國(guó)務(wù)院于1999 年5 月頒布的《飼料和飼料添加劑管理?xiàng)l例》中明確規(guī)定：“生產(chǎn)飼料和飼料添加劑不得添加激素類藥品?！狈謩e于2002 年2 月、4 月和2010 年12 月農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第176 號(hào)》（《禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥物品種目錄》）、《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第193 號(hào)》（《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》）和《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1519 號(hào)》（《禁止在飼料和動(dòng)物飲水中使用的物質(zhì)》）明確禁用涉及腎上腺素受體激動(dòng)劑、性激素和具激素作用物質(zhì)，這3 類中共34 種激素類藥物。隨著食品安全意識(shí)的進(jìn)一步提高，加強(qiáng)飼料中激素類藥物殘留的監(jiān)管是必要手段之一，而研究使用無(wú)毒無(wú)害、低殘留、無(wú)污染藥物添加劑的安全飼料是必然的發(fā)展方向。

1.2 常用的飼料激素類藥物及其危害

1.2.1β-腎上腺素受體激動(dòng)劑

腎上腺素受體激動(dòng)劑是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理作用與腎上腺素相似的藥物，主要通過(guò)激活腎上腺素受體或促進(jìn)去甲腎上腺素能神經(jīng)末梢釋放遞質(zhì)而產(chǎn)生與交感神經(jīng)興奮時(shí)相似的效應(yīng)［2］，按其對(duì)受體選擇性分為α受體激動(dòng)劑和β受體激動(dòng)劑等。腎上腺素受體激動(dòng)劑是我國(guó)飼料中主要違禁添加藥物四大類之一，共有15 種，均為β-受體激動(dòng)劑，又稱β-興奮劑。β-興奮劑作用類似于生長(zhǎng)激素，其中應(yīng)用最典型的是克倫特羅。近年來(lái)，沙丁胺醇、萊克多巴胺、西馬特羅、特布他林等應(yīng)用也較為廣泛，這些藥物俗稱“瘦肉精”，是一類平喘藥，具有機(jī)體能量重分配的作用，能促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體蛋白質(zhì)沉積，抑制脂肪沉積，有效提高動(dòng)物胴體瘦肉率，還能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，改善飼料效率［5］。研究表明，β-興奮劑在動(dòng)物組織形成的高濃度殘留會(huì)以其原形或代謝產(chǎn)物的形式對(duì)人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害，人食用了高殘留量的“瘦肉精”動(dòng)物產(chǎn)品后，會(huì)出現(xiàn)諸如呼吸困難、肌肉震顫等中毒癥狀，還能通過(guò)胎盤屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi)產(chǎn)生蓄積［6］，從而造成危害。

目前，世界上較多國(guó)家將此類藥物列為禁用藥物，我國(guó)嚴(yán)禁在畜牧業(yè)生產(chǎn)中使用各種β-興奮劑類藥物并將畜禽產(chǎn)品中的“瘦肉精”列為食品安全日常主要監(jiān)控項(xiàng)目；國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）、歐盟、日本等國(guó)家和地區(qū)均制定了鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺在牛、馬等動(dòng)物靶組織或產(chǎn)品中的殘留限量，限量值分別在0.05～0.6 μg／kg 和10～450 μg／kg 之間［7］；根據(jù)2001 年美國(guó)允許使用獸藥名單，鹽酸克倫特羅仍作為擬腎上腺素類藥物使用。

1.2.2 生長(zhǎng)激素

生長(zhǎng)激素是一種生長(zhǎng)促進(jìn)劑和胴體品質(zhì)改良劑，具有提高畜禽生產(chǎn)性能的潛力。近年來(lái)在畜牧業(yè)主要應(yīng)用的是豬生長(zhǎng)激素（PST）和牛生長(zhǎng)激素（BST），研究表明生長(zhǎng)激素會(huì)增加動(dòng)物熱應(yīng)激的發(fā)生率，BST 會(huì)導(dǎo)致奶牛乳房炎，還具有直接性致酮病的作用。對(duì)于這兩類激素的應(yīng)用仍有爭(zhēng)議，部分國(guó)家認(rèn)為對(duì)人類健康無(wú)不良影響，并批準(zhǔn)其在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用，而歐盟認(rèn)為含生長(zhǎng)激素的牛肉對(duì)人體健康不安全，因而禁止從美國(guó)和加拿大兩國(guó)進(jìn)口牛肉已達(dá)10 多年，我國(guó)已禁止其在飼料添加劑中 使用。

1.2.3 性激素

性激素是主要由性腺（睪丸和卵巢）產(chǎn)生和分泌的甾體激素，腎上腺皮質(zhì)也能少量分泌甾體激素。其在飼料中應(yīng)用最廣泛的種類有雌激素、孕激素、雄激素和促性腺激素；最常見的品種有己烯雌酚、雌二醇、戊酸雌二醇、苯甲酸雌二醇等雌激素類藥物，諾龍、睪酮、雄烯二酮等雄激素類藥物，黃體酮、炔諾酮、醋酸氯地孕酮等孕激素類藥物以及絨促性素、促卵泡生長(zhǎng)激素等促性腺激素類藥物。性激素應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中可促進(jìn)蛋白合成、增重和骨骼鈣化，并能減少飼料消耗。大量研究證實(shí)，這類藥物易在動(dòng)物組織中積累，進(jìn)入人體后會(huì)使人體發(fā)育異常，致性早熟，對(duì)人類繁衍子孫后代造成不良后果。世界上較多國(guó)家將性激素列為飼料中禁用或違禁藥物，我國(guó)和日本、美國(guó)以及歐盟將己烯雌酚、甲基睪酮、醋酸甲羥基孕酮作為動(dòng)物源性食品禁用 獸藥。

1.2.4 糖皮質(zhì)激素

糖皮質(zhì)激素是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一類甾體激素，具有調(diào)節(jié)糖、脂肪和蛋白質(zhì)的生物合成和代謝的作用［3］。常用的糖皮質(zhì)激素類藥物有氫化可的松、可的松等短效激素，強(qiáng)的松、強(qiáng)的松龍等中效激素，地塞米松、倍他米松等長(zhǎng)效激素［8］，這類藥物在養(yǎng)殖業(yè)中具有使畜禽增重和脂肪再分配的作用。動(dòng)物源性食品中的糖皮質(zhì)激素殘留大量進(jìn)入人體后可引起人體物質(zhì)代謝和水鹽代謝紊亂、誘發(fā)或加重感染、引發(fā)消化系統(tǒng)并發(fā)癥及心血管系統(tǒng)并發(fā)癥、造成骨質(zhì)疏松及椎骨壓迫性骨折、神經(jīng)精神異常，易引發(fā)白內(nèi)障和青光眼。因此作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑，糖皮質(zhì)激素類藥物已被各國(guó)禁止在飼料中添加使用；我國(guó)和歐盟針對(duì)不同動(dòng)物源性食品中的地塞米松和倍他米松規(guī)定了最大限量，均分布為0.3～2 μg／kg 和0.75～2 μg／kg，歐盟還對(duì)甲基波尼松龍的最大限量做出了10 μg／kg 的規(guī)定。

1.2.5 其它

蛋白同化激素是指同化類固醇即由雄激素衍生出的一系列人工合成類固醇，雄性化作用顯著減弱，而蛋白同化作用增強(qiáng)［9］。這類藥物在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中經(jīng)常使用，起促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)和提高飼料轉(zhuǎn)化率的作用，研究表明其在動(dòng)物源性食品中的殘留對(duì)人體具有潛在的致癌性，應(yīng)用最廣泛的為我國(guó)已禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的碘化酪蛋白和苯丙酸諾龍，農(nóng)業(yè)部還規(guī)定丙酸睪酮、苯丙酸諾龍、甲睪酮、群勃龍等蛋白同化激素不得在動(dòng)物性食品中檢出。甲狀腺激素是甲狀腺所分泌的激素，為氨基酸衍生物，有促進(jìn)新陳代謝和發(fā)育、提高神經(jīng)系統(tǒng)興奮性的作用。其對(duì)水產(chǎn)品生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，能夠加快魚類生長(zhǎng)、調(diào)控魚的非特異性免疫功能［10］，作為飼料添加劑的有害作用尚在研究探討中。具激素樣作用物質(zhì)典型如玉米赤霉醇和碘化酪蛋白亦屬于我國(guó)飼料和動(dòng)物飲用水中違禁藥物類別，目前我國(guó)非法使用這類藥物于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖的情況時(shí)有發(fā)生，如若食入含有這類藥物殘留的產(chǎn)品，則可能干擾人的激素功能，影響生育能力、導(dǎo)致兒童的性早熟等［11］。

2 飼料中激素類藥物的樣品前處理及分析技術(shù)

2.1 樣品前處理技術(shù)

飼料樣品組成復(fù)雜、組分濃度低、干擾物質(zhì)多、易受環(huán)境影響，含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)等，需要經(jīng)過(guò)一定的前處理過(guò)程才能進(jìn)行分析測(cè)定。樣品的前處理過(guò)程中提取凈化是關(guān)鍵，直接影響分析的準(zhǔn)確度、靈敏度和重現(xiàn)性。目前，快速、高效、簡(jiǎn)便、綠色的樣品前處理技術(shù)應(yīng)用于飼料安全檢測(cè)領(lǐng)域已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。

2.1.1 提取和純化

激素類藥物殘留分析中常用的提取溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、乙醚和乙酸乙酯等，基于溶劑自身特性和樣品基質(zhì)來(lái)說(shuō)，甲醇、乙腈和丙酮易與樣品結(jié)合、提取速度快，乙醚和乙酸乙酯適于提取脂溶性化合物。

在樣品前處理過(guò)程中加入變性劑、有機(jī)溶劑和中性鹽等能有效去除蛋白質(zhì)，三氯乙酸是常用的蛋白質(zhì)沉淀劑，它能使蛋白質(zhì)變性或脫水沉淀；常用的有機(jī)溶劑包括甲醇、乙腈、丙酮和乙醇等；常用的中性鹽有飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽和磷酸鹽等［12］。通常采用的除脂方法有冷凍凝固后離心、磺化或皂化法以及利用有機(jī)溶劑溶解等。

2.1.2 凈化和濃縮

飼料樣品的凈化和濃縮常用的有液-液萃取技術(shù)（Liquid-Liquid Extraction, LLE）、固相萃取技術(shù)（Soild Phase Extraction, SPE）、基質(zhì)分散固相萃取 技 術(shù)（Matrix Solid-Phase Dispersion, MSPD）、QuEChERS 技 術(shù)（Quick、Easy、Cheap、Effective, Rugged, Safe）、固 相 微 萃 取 技 術(shù)（Solid-Phase Microextraction, SPME）、超臨界流體萃取技術(shù)（Supercritical Fluid Extraction, SFE）等，選擇合適且有效的凈化濃縮方法對(duì)飼料中激素類藥物含量的檢測(cè)分析是至關(guān)重要的。

LLE 是利用物質(zhì)在兩種互不相溶或微溶的溶劑中溶解度或分配系數(shù)的不同，使溶質(zhì)從一種溶劑內(nèi)轉(zhuǎn)移至另一種溶劑中的方法。Mu?iz-Valencia R等［13］采用該方法對(duì)飼料中類固醇類藥物進(jìn)行提取凈化，方法簡(jiǎn)單易操作。LLE 的不足之處在于選擇性較差，樣品多次轉(zhuǎn)移濃縮造成操作耗時(shí)較長(zhǎng)，分析誤差較大、回收率相對(duì)較低，有機(jī)溶劑消耗量大，溶劑浪費(fèi)、溶劑大量揮發(fā)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的健康危害和環(huán)境污染問(wèn)題突出。

SPE 是利用固相吸附劑吸附待測(cè)化合物，分離樣品基體和干擾物，再用洗脫液洗脫，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的［14］，一般包括活化、上樣、淋洗和洗脫4 個(gè)步驟。它與傳統(tǒng)的液-液萃取方法相比，具有明顯的優(yōu)勢(shì)，提高樣品處理通量的同時(shí)減少了溶劑的消耗，可有效降低樣品基質(zhì)效應(yīng)，回收率高、重現(xiàn)性好，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制等。有報(bào)道稱使用該方法對(duì)于飼料中類固醇激素［15-17］、腎上腺素受體激動(dòng)劑［18］等回收率為75.9%～112.08%，精密度為5.11%～22.74%（n=5），均能達(dá)到檢測(cè)要求。SPE 的不足之處在于過(guò)程繁瑣，且洗脫溶劑的選擇、活化時(shí)間、洗脫體積、流量和過(guò)濾等較多因素影響萃取 效果。

MSPD 是一種快速樣品前處理技術(shù)，它是在SPE 技術(shù)的基礎(chǔ)上改進(jìn)的，不同之處在于填料是采用涂漬有C18等多種聚合物的擔(dān)體固相萃取材料與樣品一起研磨而得的半干狀態(tài)混合物。MSPD 適用于多種藥物的殘留分析，如呂建霞等［19］運(yùn)用分散固相萃取的方法凈化測(cè)定飼料中人工合成的3 種非甾類雌激素，平均回收率為93.1%～121.0%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4.1%（n=3）；應(yīng)永飛［20］采用碳納米管分散固相萃取結(jié)合的方式測(cè)定飼料中11種β-受體激動(dòng)劑，方法平均回收率為80.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7.47%（n=3）；羅輝泰等［21］建立了飼料中包括17 種β-受體激動(dòng)劑在內(nèi)的87 種獸藥同時(shí)測(cè)定的方法，其中前處理采用了Bondesil-PSA吸附劑以分散固相萃取方式快速凈化技術(shù)，87 種藥物的平均回收率為63.7%～108.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.5%～15.2%（n=6），以上方法回收率、重現(xiàn)性和靈敏度均滿足檢測(cè)要求。MSPD 萃取過(guò)程簡(jiǎn)單，減少了樣品的損失，溶劑用量少，但最顯著的缺點(diǎn)在于取樣量小，檢測(cè)限相對(duì)較高。

QuEChERS 是利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而達(dá)到除雜凈化目的的一種前處理方法。只要是待測(cè)目標(biāo)物的回收率滿足要求，去除雜質(zhì)的基質(zhì)背景滿足檢測(cè)的需求，則可以采用該方法凈化，因此應(yīng)用廣泛。鄭玲等［22］采用了QuEChERS 方法檢測(cè)飼料中18 種β-興奮劑，結(jié)果顯示，加入C18和PSA 吸附劑分散固相萃取凈化后，基質(zhì)效應(yīng)低、回收率高，平均回收率為78.4%～107.1%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.5%～12.3%（n=6），溶劑用量小、操作簡(jiǎn)單快速。在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，QuEChERS 方法對(duì)含水量低或者脂肪含量高的樣品凈化效果不理想，提取效率低、凈化過(guò)程損失大。

SPME 是針對(duì)SPE 存在的問(wèn)題，基于聚二甲基硅氧烷吸附而發(fā)展的微萃取技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)高沸點(diǎn)化合物的快速進(jìn)樣、操作簡(jiǎn)單、富集程度自動(dòng)化程度高［23］，它的優(yōu)點(diǎn)在于排除了基質(zhì)對(duì)樣品的影響能力，便于使用以及減少溶劑消耗或無(wú)溶劑消耗。SFE 是一種新型樣品前處理技術(shù)，常用的超臨界流體為超臨界CO2，超臨界流體沒(méi)有表面張力極易穿進(jìn)樣品基質(zhì)中，在不同的溫度和壓力下能提取極性或分子大小不同的物質(zhì)。超臨界流體萃取有3 種收集方法：溶劑捕集法、吸附劑吸附捕集法和固體表面冷凍捕集法，具有速度快、萃取效率高、準(zhǔn)確性好、節(jié)省溶劑等特點(diǎn)。亞臨界流體萃取與SFE原理相似，利用物質(zhì)在亞臨界狀態(tài)下對(duì)溶質(zhì)的高溶解能力且在低于亞臨界狀態(tài)下對(duì)溶質(zhì)的低溶解能力這一特性實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的提取和分離，馬勒川［24］利用亞臨界R134a 萃取結(jié)合高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)水產(chǎn)品中激素殘留檢測(cè)進(jìn)行了研究，表明亞臨界R134a相比超臨界CO2對(duì)油脂的分離更有效，具有更好的溶劑性能、較高的提取效率和較高的回收率，因此應(yīng)用亞臨界萃取技術(shù)對(duì)飼料激素殘留檢測(cè)具有廣泛的應(yīng)用前景。

2.2 分析測(cè)定技術(shù)

2.2.1 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜（HPLC）法相較于液相色譜法運(yùn)用了顆粒極細(xì)、規(guī)則均勻的固定相提高分離效率，采用高壓輸液泵輸送流動(dòng)相縮短分析時(shí)間，使用高靈敏檢測(cè)器提高了檢測(cè)靈敏度［25］。HPLC 廣泛應(yīng)用于飼料激素殘留檢測(cè)領(lǐng)域，邸萬(wàn)山［26］采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器測(cè)定動(dòng)物飼料中的鹽酸克倫特羅，回收率和測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分 別 為97.8%～99.2% 和0.13%（n=3）；張 素 霞等［27］利用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器對(duì)飼料中的萊克多巴胺進(jìn)行測(cè)定，平均回收率和測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為89.8%和2.16%（n=6），方法檢測(cè)限為0.48 mg／kg；劉紅菊等［28］采用固相萃取反相高效液相色譜法對(duì)飼料中10 種性激素進(jìn)行測(cè)定，10 種性激素線性關(guān)系良好，加標(biāo)回收率為95.32%～102.5%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.8%（n=5）；李蘭等［29］采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)飼料中的5 種糖皮質(zhì)激素，回收率大于66.5%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于10.6%（n=3）；祝曙華［30］建立了超高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)飼料中潑尼松、甲基潑尼松龍、倍氯米松、氟氫可的松、醋酸可的松5 種糖皮質(zhì)激素，回收率為83.83%～94.04%，檢測(cè)限為0.03～0.05 mg／kg。高效液相色譜法分離速度快、檢測(cè)效率高、重現(xiàn)性好，70%以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析。國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中也有采用HPLC 的，如農(nóng)業(yè)部1068 號(hào)公告-2-2008 《飼料中5種糖皮質(zhì)激素的測(cè)定高效液相色譜法》，方法最低檢出限為0.5～1.0 mg／kg，能滿足日常檢測(cè)需求。高效液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”，如果流動(dòng)相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留均會(huì)顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。

2.2.2 免疫分析法

免疫分析法是一種具有高選擇性和低檢出限、利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)建立的生物化學(xué)分析法，分為熒光免疫法、發(fā)光免疫法、免疫法及電化學(xué)免疫法等非放射免疫法和放射免疫法［31］。用于飼料中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、地塞米松、雙氟米松、倍他米松、曲安西龍、潑尼松龍等藥物殘留檢測(cè)的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）商品化試劑盒已被研發(fā)出來(lái)。有報(bào)道完全競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)商業(yè)飼料中的重組牛生長(zhǎng)激素，在20～500 μg／g 有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.98，添加回收率為105%［32］。李瑞園等［33］采用ELISA 檢測(cè)飼料中己烯雌酚，結(jié)果顯示己烯雌酚線性關(guān)系良好，樣品加標(biāo)回收率為76.0%～94.2%。免疫分析法靈敏度高，快速簡(jiǎn)便、樣品純度要求不高，適用于大批量樣品的篩選，已廣泛應(yīng)用于食品和飼料檢測(cè)。其缺點(diǎn)在于操作過(guò)程稍繁瑣，特異性和靈敏性有待提高。

2.2.3 氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法

氣相色譜法（GC）是一個(gè)分析速度快和分離效率高的分析方法，基于激素高沸點(diǎn)、低揮發(fā)性的特點(diǎn)，采用氣相色譜法測(cè)定激素樣品一般需要進(jìn)行硅烷化、?；碗炕妊苌^(guò)程。氣相色譜-質(zhì)譜法包括氣相質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS／MS），方法集聚了色譜的高效分離及質(zhì)譜在檢測(cè)和確證化合物方面的優(yōu)點(diǎn)，成為激素殘留檢測(cè)中常用的技術(shù)。林小莉等［15］采用氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定飼料中6 種雌激素類藥物，檢出限為3～8 μg／kg，平均回收率為75.9%～96.3%；董艷峰等［34］用氣相色譜-質(zhì)譜定性和定量分析了飼料中兩種雌激素類藥物（己烯雌酚和17β-雌二醇），樣品檢出限為5 μg／kg，平均回收率為70%～100%。由于氣相色譜-質(zhì)譜法具有相對(duì)較高分辨率、高靈敏度、假陽(yáng)性率低的優(yōu)點(diǎn)，我國(guó)制定了一系列飼料中激素類藥物殘留檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法：NY438-2001 《飼料中鹽酸克侖特羅的測(cè)定》、NY／T1030-2006 《飼料中沙丁胺醇的測(cè)定 氣相色譜／質(zhì)譜法》、NY／T1033-2006 《飼料中西馬特羅的測(cè)定 氣相色譜／質(zhì)譜法》、農(nóng)業(yè)部1063 號(hào)公告-7-2008 《飼料中8 種β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè) 氣相色譜-質(zhì)譜法》等。

2.2.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

基于精確的定性和定量分析功能，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法越來(lái)越多的被應(yīng)用于飼料中激素類藥物檢測(cè)，大量文獻(xiàn)報(bào)道了利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS／MS）法測(cè)定飼料中β-受體激動(dòng)劑、糖皮質(zhì)激素、性激素、類固醇激素等多種激素類藥物殘 留［35-47］，方法的檢出限和定量限均能達(dá)到10-9級(jí)別，樣品加標(biāo)回收率和測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合要求，其中β-受體激動(dòng)劑類回收率為60%～105%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于11.8%（n=6）；糖皮質(zhì)激素類回收率為55.1%～88.2%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%～19.1%（n=6）；性激素和類固醇類回收率為61.7%～114.37%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%（n=6）。相較于氣質(zhì)聯(lián)用法，液質(zhì)聯(lián)用法的應(yīng)用不受沸點(diǎn)的限制并能對(duì)熱穩(wěn)定性差的待測(cè)物進(jìn)行分離、分析，具有較高的靈敏度且樣品前處理不需要進(jìn)行衍生化；相較于免疫分析法、電化學(xué)分析法、毛細(xì)管電泳法等，尤其適用于痕量藥物殘留分析的要求并能較好地對(duì)分析物進(jìn)行定性確認(rèn)。LC-MS／MS 法的選擇性好、分辨率高、能用于多種藥物的篩查，并可進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)剖析和蛋白質(zhì)序列測(cè)定，因此常常被作為確證方法使用，目前國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)飼料中激素類藥物殘留檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法均采用LC-MS／MS 測(cè)定：農(nóng)業(yè)部1068 號(hào)公告-3-2008 《飼料中10 種蛋白同化激素的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，適用于配合飼料中大力補(bǔ)、甲基睪丸酮、丙酸睪酮、睪酮、諾龍、丙酸諾龍、勃地龍、群勃龍、脫氫異雄酮、黃體酮等10 種蛋白同化激素含量的測(cè)定；農(nóng)業(yè)部1063 號(hào)公告-5-2008 《飼料中9 種糖皮質(zhì)激素的檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，適用于配合飼料、濃縮飼料及預(yù)混合飼料中潑尼松龍、潑尼松、甲基潑尼松龍、氫化可的松、倍氯米松、地塞米松、倍他米松、醋酸氟氫可的松和醋酸可的松的測(cè)定；農(nóng)業(yè)部1063 號(hào)公告-6-2008 《飼料中13 種β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，適用于飼料中克倫特羅、西馬特羅、西布特羅、氯丙那林、馬布特羅、特布他林、沙丁胺醇、齊帕特羅、班布特羅、萊克多巴胺、溴布特羅、克侖普羅和妥布特羅的 測(cè)定。

2.3 飼料激素類藥物檢測(cè)存在問(wèn)題與研究進(jìn)展

目前應(yīng)用于飼料中的激素類藥物品種繁多、性質(zhì)多樣，而有針對(duì)性的分析檢測(cè)方法發(fā)展相當(dāng)迅速，以應(yīng)對(duì)日趨重要的飼料中激素類藥物使用安全性問(wèn)題。在實(shí)際檢測(cè)中，面臨的問(wèn)題還很多，實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備、分析場(chǎng)合、分析目的、人員配備等各不相同；現(xiàn)有的以及正在研究中的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)前處理過(guò)程、方法靈敏度和精確度、方法的定性限和定量限等各不相同。因此，積極探索并運(yùn)用先進(jìn)的分析手段，快速準(zhǔn)確的測(cè)定飼料激素類藥物殘留非常重要。

近年來(lái)隨著科技的發(fā)展，涌現(xiàn)出較多飼料激素類藥物殘留檢測(cè)新方法，如高效毛細(xì)管電泳（HPCE）是一種依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離分析的新型液相分離技術(shù)，蔡春平等［48］和陳紅青［49］利用此法對(duì)飼料中的鹽酸克侖特羅和沙丁胺醇進(jìn)行檢測(cè)，均得到了滿意的結(jié)果。HPCE 與質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)在飼料激素殘留分析領(lǐng)域的應(yīng)用也逐步受到人們的關(guān)注。激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)在毛細(xì)管電泳免疫分析中應(yīng)用較多，對(duì)激素類藥物檢測(cè)有較為廣闊的前景［50-51］。超臨界流體色譜聯(lián)用技術(shù)（SFC）因超臨界流體具有氣體和液體雙重性質(zhì)的特點(diǎn)，可與大部分GC 和HPLC的檢測(cè)器相連，因此極大地拓寬了應(yīng)用范圍，Jones D C 等［52］用超臨界流體色譜-紫外檢測(cè)器-質(zhì)譜儀對(duì)克倫特羅等β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行了分離和測(cè)定，重復(fù)性好，檢測(cè)限低。時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）是一種利用時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)儀測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物中熒光強(qiáng)度的新型的體外超微量分析技術(shù)，何明祥［53］采用包被二抗間接競(jìng)爭(zhēng)法建立解離增強(qiáng)模式的熒光免疫分析體系檢測(cè)沙丁胺醇，方法特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。在樣品前處理過(guò)程中，免疫親和色譜技術(shù)、分子印跡技術(shù)、超臨界流體萃取這些新型分離純化技術(shù)正逐步得到更廣泛的應(yīng)用，黃怡等［54］建立了基于分子印跡固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定飼料中萊克多巴胺的方法，檢出限達(dá)到0.1 mg／kg，結(jié)果表明該方法用于復(fù)雜飼料基質(zhì)中萊克多巴胺檢測(cè)的效果優(yōu)于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)分析方法。

3 結(jié)語(yǔ)

迄今為止，養(yǎng)殖業(yè)中違規(guī)使用和濫用激素類藥物的現(xiàn)象依然存在，食品安全依然是被關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題，因此加強(qiáng)飼料中激素類藥物殘留的監(jiān)管是必要手段之一。而飼料中激素類藥物的殘留分析在覆蓋藥物種類和檢測(cè)方法多樣性、普適性方面仍需完善，給分析測(cè)試工作者帶來(lái)的技術(shù)難點(diǎn)較多，如何簡(jiǎn)化操作流程，提高檢測(cè)效率，如何研發(fā)新技術(shù)新手段同時(shí)測(cè)定更多種激素類藥物殘留，如何做到定性定量更準(zhǔn)確精密度更高等，將是今后一段時(shí)間針對(duì)飼料激素類藥物殘留分析需要努力的方向。