傅文婷 張欣宗 鐘興明 趙文忠 李銘臻

(廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所、國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)、男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510600 )

非梗阻性無(wú)精癥是男性不孕不育的常見(jiàn)原因，目前其確切的原因尚不完全明確。近年來(lái)的研究顯示，與精子形成、成熟有關(guān)的信號(hào)通路的功能異?；蛎赶档谋磉_(dá)異常與非梗阻性無(wú)精癥的發(fā)病有關(guān)[1.2]。Wnt信號(hào)通路是一種高度保守的信號(hào)通路，在人體發(fā)育及維持成人組織穩(wěn)態(tài)中起到非常重要的作用，也是維持睪丸正常功能和精子成熟的重要信號(hào)通路[3.4]。WNT7A基因定位于3號(hào)染色體短臂2區(qū)5帶，在睪丸組織中具有高表達(dá)，其可能參與睪丸正常的生理功能。rs139790545 是WNT7A的一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，在目前的研究中尚位見(jiàn)到其與男性非梗阻性無(wú)精癥相關(guān)聯(lián)的研究報(bào)道，為進(jìn)一步明確其在非梗阻性無(wú)精癥發(fā)病中的作用，本文就rs139790545多態(tài)性與漢族男性非梗阻性無(wú)精癥患者的發(fā)病的相關(guān)性進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所47例漢族非梗阻性無(wú)精癥患者，患者年齡24～42(32.5±4.2)歲，入選標(biāo)準(zhǔn)：①患者診斷標(biāo)準(zhǔn)符合男性非梗阻性無(wú)精癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②患者自愿納入研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：泌尿生殖道感染性疾病、輸精管堵塞、精索靜脈曲張等。選擇同期健康志愿者25例作為對(duì)照組，年齡27～43(33.1±4.1)歲，入選標(biāo)準(zhǔn)：①有正常生育史；②無(wú)家族性遺傳性疾??；③無(wú)生殖系統(tǒng)腫瘤或其他疾病。2組年齡無(wú)顯著差異，研究?jī)?nèi)容經(jīng)研究所醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。

1.2 主要試劑及儀器 TaqMan Genotyping Master Mix， SNPrs139790545G/A位點(diǎn)探針試劑盒，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，分光光度計(jì)(美國(guó)梅特勒-托利多集團(tuán)公司)。

1.3 基因組DNA提取及定量 非梗阻性無(wú)精癥患者及健康志愿者入選后，提取外周血DNA(酚/氯仿抽提法)，分別采集靜脈血2ml，EDTA抗凝，雙蒸水裂解紅細(xì)胞，1700r/min離心，沉淀加入DNA裂解液重懸，加入蛋白酶溫育30min，苯酚/氯仿/戊乙醇抽提，反復(fù)洗滌，去離子水重懸至20μ/L，分光光度計(jì)測(cè)量DNA的濃度及純度。

1.4WNT7A基因SNP rs139790545位點(diǎn)基因分型 樣本采用人基因組rs139790545 (C/A)多態(tài)性位點(diǎn)TaqMan探針?lè)中驮噭┖袑?duì)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型進(jìn)行檢測(cè)，ABI Stepone Plus RT PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體積10μl(DNA模板1.5μl，40(TaqMan SNP Genotyping AssayMix 0.25μl，2(TaqMan GenotypingMaster Mix5μl，DDH2O 3.25μl)，熱變性溫度95℃，時(shí)間10min，92℃，時(shí)間15s，退火溫度60℃，時(shí)間1min，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。StepOneSoftware v2.2軟件分析熒光信號(hào)，通過(guò)散點(diǎn)圖分析基因型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，基因型及等位基因頻率為計(jì)數(shù)資料，比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)算OR值及95%CI，HWE軟件進(jìn)行Hardy-Wenberg平衡檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1WNT7A基因 rs139790545位點(diǎn)等位基因及基因型 對(duì)照組25名志愿者基因型分布符合Hardy-Wein-berg平衡(P=1.0)。非梗阻性無(wú)精癥患者與健康志愿者之間rs139790545位點(diǎn)等位基因及基因型分布存在顯著差異(P<0.05)，非梗阻性無(wú)精癥患者A等位基因及AA基因型的發(fā)生頻率高于健康志愿組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2WNT7A基因 rs139790545位點(diǎn)基因型與非梗阻性無(wú)精癥的患病風(fēng)險(xiǎn)WNT7A基因 rs139790545位點(diǎn)基因型分析結(jié)果顯示，基因型AA增加非梗阻性無(wú)精癥的患病風(fēng)險(xiǎn)(0R=2.842，95%CI=1.776-3.988)，GG、GA基因型不增加非梗阻性無(wú)精癥的患病風(fēng)險(xiǎn)(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表1 梗阻性無(wú)精癥患者和健康志愿者rs139790545位點(diǎn)等位基因及基因型分布

表2 WNT7A基因rs139790545位點(diǎn)基因型與非梗阻性無(wú)精癥的患病風(fēng)險(xiǎn)

3 討論

非梗阻性無(wú)精癥是男性不育的原因之一，其根本原因是精子的形成或成熟障礙。在精子的形成和成熟過(guò)程中，有超過(guò)2000個(gè)基因參與，其中部分基因的多態(tài)性與精子的形成和成熟有關(guān)，其中任何基因發(fā)生突變，均可能導(dǎo)致精子的成熟障礙，最終導(dǎo)致男性不育癥的發(fā)生。WNT基因家族是高度保守的序列，在不同物種上保持高度的同源性，主要通過(guò)和膜蛋白受體結(jié)合調(diào)控下游信號(hào)通路的活性，進(jìn)而將細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)。其信號(hào)傳遞通過(guò)多種經(jīng)典的信號(hào)通路完成，如WNT/β-catenin信號(hào)通、平面細(xì)胞極性通路、WNT/Ca+通路、PLC通路和PKC通路等，參與腫瘤細(xì)胞的增殖，精原細(xì)胞的分化及成熟等過(guò)程[5-7]。

近年來(lái)的研究顯示，WNT7A基因在動(dòng)物的性成熟、精子的形成以及胚胎發(fā)育中具有重要的作用。有研究顯示[8]，多氯聯(lián)苯能通過(guò)抑制女性生殖道中的WNT7A信號(hào)通路發(fā)揮雌激素效應(yīng)，調(diào)節(jié)生殖道的發(fā)育，其中WNT7A信號(hào)通路的活性發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。而且在精原細(xì)胞分化程度的過(guò)程中，也有WNT/β信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控作用[7]。在非梗阻性無(wú)精癥的發(fā)病過(guò)程中，相關(guān)基因的多態(tài)性發(fā)揮著重要的作用，孫亞麗等人研究顯示[9]，HLA-A抗原基因多態(tài)性與非梗阻性無(wú)精癥的發(fā)病有關(guān)，其中攜帶HLA.26比01型基因增加發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。王嬋娟等[10]認(rèn)為SRPA-IRPG基因rs6080550位點(diǎn)的多態(tài)性與發(fā)病有關(guān)，其中攜帶TT基因型的男性非梗阻性無(wú)精癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯升高。也提示基因多態(tài)性在梗阻性無(wú)精癥發(fā)病中的重要作用。研究顯示[11]，在非梗阻性無(wú)精癥患者中，睪丸WNT/β-Catenin信號(hào)通路異常，在非梗阻性無(wú)精子癥男性間質(zhì)細(xì)胞β-Catenin異常聚集，其可能與精子成熟障礙有關(guān)。另外一項(xiàng)研究顯示，DKK3能夠通過(guò)影響WNT/β-CATENIN信號(hào)通路的活性對(duì)精元細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程進(jìn)行調(diào)控。也說(shuō)明WNT信號(hào)傳導(dǎo)通路可能在非梗阻性無(wú)精癥的發(fā)病中具有重要的作用。其中存在著對(duì)精子發(fā)生及成熟過(guò)程的基因位點(diǎn)，其對(duì)精子發(fā)生、成熟過(guò)程的調(diào)控，可能有基因多態(tài)性因素的參與。

rs139790545定位于WNT7A基因，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，其第二外顯子上存在基因多態(tài)性位點(diǎn)，通過(guò)基因分型發(fā)現(xiàn)，在梗阻性無(wú)精癥患者和健康志愿者之間，其AA基因型表達(dá)頻率存在明顯差異，進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，WNT7A基因rs139790545位點(diǎn)的基因多態(tài)性與非梗阻性無(wú)精癥存在關(guān)聯(lián)，rs139790545位點(diǎn)攜帶AA基因型增加非梗阻性無(wú)精癥的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，WNT7A基因rs139790545位點(diǎn)多態(tài)性與非梗阻性無(wú)精癥有關(guān)，AA基因型增加非梗阻性無(wú)精癥的風(fēng)險(xiǎn)，其位點(diǎn)的基因多態(tài)性及基因突變可能是非梗阻性無(wú)精癥的原因之一，由于結(jié)果僅為小樣本研究，尚存在一定的局限性，尚需要在后續(xù)的研究中增加樣本量，進(jìn)一步證實(shí)研究結(jié)果的可靠性。