肖慧琳，李俊瑋，劉萬(wàn)好，盧建聲，王建萍，鄭秋玲，張超杰，慈志娟，劉笑宏，宮 磊，唐美玲

（1.山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東煙臺(tái) 265500；2.煙臺(tái)張?jiān)Ｆ咸厌劸乒煞萦邢薰荆綎|煙臺(tái) 264000；3.山東省葡萄研究院，山東濟(jì)南 250100）

黑虎香葡萄屬鮮食、制汁和釀酒兼用品種。自20世紀(jì)90年代引入煙臺(tái)之后，在雨熱同季氣候條件下，易管、豐產(chǎn)、抗病、抗凍。單品種釀造葡萄酒果香濃郁，口感柔順，清爽平衡，新鮮易飲，具有較大的釀酒開(kāi)發(fā)潛力[1]。

脫落酸（abscisic acid，ABA）是一類(lèi)重要的內(nèi)源植物激素，參與促進(jìn)呼吸躍變型和非呼吸躍變型果實(shí)的成熟[2-3]，在葡萄果實(shí)成熟過(guò)程中能夠促進(jìn)果實(shí)著色、增糖降酸和果實(shí)軟化[4-10]。近年來(lái)對(duì)鮮食和釀酒葡萄研究發(fā)現(xiàn)，外源ABA處理可以促進(jìn)葡萄果實(shí)酚類(lèi)物質(zhì)積累，促進(jìn)果實(shí)著色[11-12]，增加香氣物質(zhì)的種類(lèi)和含量，改善釀酒葡萄及葡萄酒的品質(zhì)[13]。

DAVIES C等[14]研究認(rèn)為，ABA能夠促進(jìn)果實(shí)著色，提高果實(shí)品質(zhì)，但對(duì)于不同樹(shù)種和品種的作用濃度、作用時(shí)間仍需進(jìn)行系統(tǒng)的試驗(yàn)，針對(duì)不同品種特性確定出不同方案。雖然黑虎香栽培表現(xiàn)良好，但由于生長(zhǎng)季短，果實(shí)采收時(shí)相對(duì)常規(guī)釀酒葡萄品種顏色較淺，酸高糖低。因此對(duì)黑虎香葡萄轉(zhuǎn)色期噴施不同濃度ABA，探明外源ABA對(duì)黑虎香葡萄酒品質(zhì)的影響，篩選最佳處理濃度，為配套黑虎香優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑虎香：2013年定植于山東省煙臺(tái)市牟平區(qū)姜各莊鎮(zhèn)大莊村，自根苗，南北行向，株、行距4.0 m×3.5 m，架式為飛鳥(niǎo)架，新梢間距為13 cm，土壤類(lèi)型為沙壤土，常規(guī)管理。

焦亞硫酸鉀（分析純）、商業(yè)釀酒酵母ADT：上海鼎唐國(guó)際貿(mào)易有限公司；ABA（分析純）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；2-辛醇（純度＞98%）：美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；L3S可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；GL-20G-Ⅱ離心機(jī)：中國(guó)安科控股有限公司；GCMS-QP2010ULtra氣質(zhì)聯(lián)用儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

于葡萄轉(zhuǎn)色期（2018年9月18日）用ABA均勻噴淋果實(shí)，設(shè)置3個(gè)質(zhì)量濃度：25 mg/L、100 mg/L和500 mg/L，用清水作對(duì)照，每個(gè)濃度處理10株，3次重復(fù)。于成熟期（2018年10月24日）采收。果實(shí)采收后除梗破碎，置于5 L玻璃罐中，添加焦亞硫酸鉀0.12 g/L、商業(yè)釀酒酵母ADT 0.3 g/L，于20～25 ℃進(jìn)行小容器發(fā)酵10 d，酒液比重達(dá)0.997以下并保持不變后，汁渣分離，將自流酒和壓榨酒混合，酒液澄清后取上清進(jìn)行滿(mǎn)瓶陳釀，陳釀3個(gè)月后進(jìn)行品質(zhì)測(cè)定。

1.3.2 基本理化指標(biāo)測(cè)定

還原糖：斐林試劑滴定法（以葡萄糖計(jì)）[15]；可滴定酸：電位滴定法（以酒石酸計(jì)）；pH值：PHS-3C pH計(jì)測(cè)定；酒精度：比色法[16]；干浸出物：密度瓶法[15]；pH示差法[17]、福林丹尼斯法[18]、福林酚法[19]依次測(cè)定花色苷、單寧、總酚含量，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

1.3.3 揮發(fā)性香氣成分測(cè)定

取5 mL葡萄酒樣品置于20 mL頂空瓶中，加入10 μL質(zhì)量濃度為50 μg/mL的2-辛醇作內(nèi)標(biāo)，將老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于45 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進(jìn)樣口，于250 ℃解吸3 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。采集數(shù)據(jù)后經(jīng)MS-DIAL program3.40軟件解卷積處理并計(jì)算保留指數(shù)，得到各保留時(shí)間的化合物名稱(chēng)，峰面積及保留指數(shù)，以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)，對(duì)揮發(fā)性香氣成分定量分析。

氣相色譜-質(zhì)譜條件：毛細(xì)管色譜柱為DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：45 ℃保持1 min，以6.0 ℃/min升溫至230 ℃，保持4 min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，高純氦氣流速1.0mL/min。質(zhì)譜接口溫度250℃，電子電離（electronionization，EI）源，電子能量70 eV，檢測(cè)器電壓1 000 V。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010，用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.05），采用MetaboAnalyst 4.0進(jìn)行偏最小二乘法-判別分析（partial least square-discriminat analysis，PLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度ABA噴施果實(shí)對(duì)黑虎香葡萄酒基本理化指標(biāo)的影響

浸出物含量的多少?zèng)Q定葡萄酒的主體骨架，充足的干浸出物使酒質(zhì)圓滑，而干浸出物低的葡萄酒則口感淡薄[20]。由表1可知，100 mg/L、500 mg/L ABA處理葡萄酒酒精度均顯著提高（P＜0.05），500 mg/L ABA處理酒精度比對(duì)照組提高12.1%；殘?zhí)呛繜o(wú)顯著差異（P＞0.05）；總酸含量均顯著降低（P＜0.05），25 mg/L ABA處理總酸含量降低15.5%；25 mg/L ABA處理干浸出物含量顯著低于對(duì)照（P＜0.05），100 mg/L ABA處理、500 mg/L ABA處理干浸出物含量分別比對(duì)照增加32.8%、33.4%，顯著提升了葡萄酒口感。與權(quán)桂蓉等[13]用100 mg/L ABA在赤霞珠葡萄上研究結(jié)果一致。

表1 不同處理黑虎香葡萄酒基本理化指標(biāo)Table 1 Basic physiochemical indexes of Heihuxiang wine with different treatments

葡萄酒的酒精度和酸主要來(lái)源于葡萄果實(shí)的糖和酸。本試驗(yàn)結(jié)果表明，ABA處理增加了成熟期葡萄含糖量，降低酸含量。與前人在巨峰、紅提、赤霞珠和蛇龍珠[21-24]等的研究結(jié)果一致，可能是因?yàn)橥庠碅BA調(diào)節(jié)ATPase 酶活性，促進(jìn)漿果內(nèi)糖分的卸載，提高轉(zhuǎn)化酶的活性，最終提高漿果內(nèi)糖分的含量[21，25]。同時(shí)，ABA是葡萄重要的成熟啟動(dòng)因子，當(dāng)ABA含量積累到一定程度時(shí)就會(huì)開(kāi)始對(duì)葡萄果實(shí)的成熟衰老進(jìn)行調(diào)控[26]，外源ABA處理能通過(guò)上調(diào)ABA的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)來(lái)促進(jìn)水果的軟化、成熟和衰老[27-28]。

2.2 不同濃度ABA噴施對(duì)黑虎香葡萄酒酚類(lèi)物質(zhì)含量的影響

表2 不同處理黑虎香葡萄酒酚類(lèi)物質(zhì)含量Table 2 Phenolic content of Heihuxiang wine with different treatments

酚類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)和含量決定了葡萄酒的色澤、口感和陳釀潛力，而葡萄酒酚類(lèi)物質(zhì)主要來(lái)自葡萄果實(shí)。因此，增加葡萄果實(shí)中酚類(lèi)物質(zhì)含量對(duì)于以?xún)?yōu)質(zhì)葡萄酒生產(chǎn)為目標(biāo)的葡萄栽培和相應(yīng)的釀造工藝的確定都有重要的參考價(jià)值。黑虎香相對(duì)傳統(tǒng)釀酒葡萄品種而言，其葡萄酒中花色苷含量偏低，由表2可知，果實(shí)噴施外源ABA顯著增加了葡萄酒中花色苷和總酚的含量，隨著噴施濃度的增加，花色苷含量分別為對(duì)照組的2.1倍、2.0倍和2.4倍，總酚含量分別比對(duì)照組提高4%、9.9%和17.9%。有研究人員認(rèn)為ABA促進(jìn)著色的主要原因是ABA上調(diào)了花色苷合成途徑關(guān)鍵酶基因VvCHI、VvF3H、VvDFR、VvLDOX、VvUFGT和轉(zhuǎn)錄因子VvmybA1的表達(dá)，顯著增加酚類(lèi)物質(zhì)的含量[29-33]，促進(jìn)果實(shí)成熟和著色，進(jìn)而提升葡萄酒顏色和口感。本實(shí)驗(yàn)中單寧的變化規(guī)律與花色苷和總酚不同，只有500 mg/L ABA處理下顯著增加（P＜0.05），25 mg/L和100 mg/L ABA處理與對(duì)照葡萄酒單寧含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），這與前人研究結(jié)果一致[34-36]。

2.3 不同濃度ABA噴施對(duì)黑虎香葡萄酒揮發(fā)性香氣的影響

揮發(fā)性香氣成分是衡量葡萄酒品質(zhì)的重要指標(biāo)，其種類(lèi)、含量、閾值及其之間的相互作用共同構(gòu)成了葡萄酒香氣的風(fēng)格特征和典型性。由表3可知，噴施ABA未增加黑虎香葡萄酒中揮發(fā)性香氣成份種類(lèi)，處理和對(duì)照黑虎香葡萄酒均檢測(cè)出62種揮發(fā)性香氣成分，其中包括30種酯類(lèi)，7種醇類(lèi)，7種酮類(lèi)，8種醛類(lèi)和10種萜烯類(lèi)。酯類(lèi)以乙酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸己酯為主，醇類(lèi)以苯乙醇、壬醇和正己醇為主，酮類(lèi)以香葉基丙酮和2,3-戊二酮為主，醛類(lèi)和萜烯類(lèi)分別以乙縮醛二乙醇和里那醇為主。

表3 不同濃度脫落酸處理黑虎香葡萄酒揮發(fā)性香氣成分Table 3 Aroma components of Heihuxiang wine with different concentrations of abscisic acid

續(xù)表

ABA處理降低黑虎香葡萄酒酯類(lèi)比例，增加醇、醛、酮、萜烯類(lèi)比例，且隨處理濃度增加，酯類(lèi)比例分別降低8.1%、12.5%和12.3%，醇類(lèi)比例分別增加40.3%、30.4%和29.9%，酮類(lèi)比例分別增加27.9%、43.7%和72.1%，醛類(lèi)比例分別增加7.3%、86.0%和82.3%，萜烯類(lèi)比例分別增加48.6%、15.5%和25.3%。

2.4 外源ABA噴施果實(shí)對(duì)揮發(fā)性香氣成分的影響程度

以檢測(cè)到的酯類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)和萜烯類(lèi)組分含量為變量，分別進(jìn)行偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）。從圖1a～圖1e可以看出，噴施外源ABA對(duì)黑虎香葡萄酒香氣成分影響較大的包括乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇、壬醇、戊二酮、香葉基丙酮、乙縮醛、香茅醇和香葉醇，得分均大于1。除25 mg/L ABA處理情況下乙酸乙酯含量最高外，其他成分均以500 mg/L ABA處理組葡萄酒中的含量最高。對(duì)上述成分含量進(jìn)行顯著性分析（表3）發(fā)現(xiàn)，500 mg/L ABA處理下除了乙酸乙酯含量顯著低于對(duì)照組外（P＜0.05），其余成分均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。其中乙酸苯乙酯、苯乙醇、壬醇、戊二酮、香葉基丙酮、乙縮醛、香茅醇和香葉醇含量分別提高100.5%、27.8%、68.1%、170.5%、116.7%、91.8%、76.7%和78.0%。

葡萄酒香氣成分按來(lái)源可分為三類(lèi)：品種香氣、發(fā)酵香氣和陳釀香氣[37]。本試驗(yàn)中，在品種、發(fā)酵和陳釀條件一定的情況下，葡萄酒香氣成分的差別主要來(lái)源于采收期葡萄果實(shí)品質(zhì)的差異。而影響葡萄香氣成分主要因素為品種、栽培技術(shù)、成熟度、生長(zhǎng)條件等，其中成熟度對(duì)香氣影響最大[38]，而外源ABA主要作用是加快葡萄成熟，這可能是本試驗(yàn)中不同濃度ABA處理下葡萄酒香氣成分含量發(fā)生變化的主要原因。有學(xué)者研究表明，轉(zhuǎn)色期用500 mg/L ABA浸蘸巨玫瑰果實(shí)，能使葡萄提早10 d成熟，葡萄果實(shí)中的萜烯類(lèi)香氣成分一般認(rèn)為從果實(shí)轉(zhuǎn)色后開(kāi)始積累，到果實(shí)成熟迅速增高[39-40]。本試驗(yàn)中ABA處理提高了葡萄酒中萜烯類(lèi)成分含量，可能是因?yàn)锳BA處理使葡萄果實(shí)提前成熟，進(jìn)而使萜烯類(lèi)物質(zhì)含量提高。處理組葡萄酒酯類(lèi)含量降低，可能由于黑虎香葡萄果實(shí)中酯類(lèi)隨著成熟度增加而損失，或者在發(fā)酵過(guò)程中酵母發(fā)酵產(chǎn)生酯類(lèi)所需的底物含量隨葡萄成熟度的增加而降低引起。

圖1 酯類(lèi)（a）、醇類(lèi)（b）、酮類(lèi)（c）、醛類(lèi)（d）和萜烯類(lèi)（e）組分含量為變量進(jìn)行的偏最小二乘法-判別分析Fig.1 Partial least squares-discrimination analysis with the content of esters (a),alcohols (b),ketones (c),aldehydes (d) and terpenes (e) as variables

3 結(jié)論

結(jié)果表明，轉(zhuǎn)色期果實(shí)噴施500 mg/L ABA可以顯著提高黑虎香葡萄酒酒精度、干浸物、花色苷和總酚含量，降低酸含量，使葡萄酒口感圓潤(rùn)、顏色加深、保健作用增強(qiáng)。顯著增加萜烯類(lèi)、醇類(lèi)和醛酮類(lèi)物質(zhì)含量，提升葡萄酒香氣質(zhì)量。但在同樣的栽培條件下，噴施ABA之后黑虎香適宜采收時(shí)間的確定，以及對(duì)果實(shí)風(fēng)味物質(zhì)影響機(jī)理有待進(jìn)一步研究。