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        圓葉葡萄籽原花色素穩(wěn)定性及其抗氧化性研究

        2021-01-10 04:07:10管敬喜廖秋眉黃江流盤豐平
        中國(guó)釀造 2020年12期
        關(guān)鍵詞:圓葉花色素葡萄籽

        管敬喜,廖秋眉,黃 羽,黃江流,黃 竟,盤豐平,楊 瑩

        (1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所,南寧 530007;2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,南寧 530007)

        圓葉葡萄(Vitis rotundifolia)為葡萄科(Vitaceae)圓葉葡萄亞屬,起源于美國(guó)東南部地區(qū)[1]。圓葉葡萄引種至我國(guó),已在廣西、浙江、成都[2-3]等地栽植成功,且可實(shí)現(xiàn)一年兩熟。圓葉葡萄品種顏色有綠色、銅色、紅色、黑色等,果實(shí)具有特殊的芳香和風(fēng)味,既可鮮食,又可加工成果酒、果汁、果脯、果醬等[4]。圓葉葡萄具有良好的抗氧化、抗菌、消炎、抗癌等功效[5-7],這些都得益于其含有的多種酚類物質(zhì)。圓葉葡萄的果皮和種子中含有大量的兒茶素、表兒茶素及其多聚體,還含有鞣花酸、沒(méi)食子酸、山柰酚、槲皮素等[8]。

        原花色素(proanthocyanidins,PAs)是植物中廣泛存在的一大類多酚化合物的總稱,由兒茶素、表兒茶素單體和不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素聚合體組成[9],能夠抗氧化、清除自由基,已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[10]。葡萄籽中的原花色素,是一種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮,是目前國(guó)際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑[11]。葡萄籽中所含多酚類物質(zhì)占整個(gè)葡萄果實(shí)酚類物質(zhì)的60%左右,葡萄籽中酚類物質(zhì)原花色素含量高達(dá)90%以上,因此提取原花色素的最好原料為葡萄籽[12]。

        本研究對(duì)諾貝爾(Noble)圓葉葡萄籽所提取的原花色素的穩(wěn)定性及抗氧化性進(jìn)行研究,以期為圓葉葡萄進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和綜合利用提供參考依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        圓葉葡萄籽:取自發(fā)酵后的諾貝爾(Noble)圓葉葡萄皮渣中,葡萄產(chǎn)地為廣西都安縣。

        原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(葡萄籽提取物,含原花色素95%):上海源葉生物科技有限公司。

        1,1-二苯-1-苦基苯肼(1,1-dipheny1-2-picryhydrazy1,DPPH)(分析純):美國(guó)Sigma公司;硫酸亞鐵、三氯化鐵、香草醛、抗壞血酸(均為分析純):天津市大茂化學(xué)試劑廠;鐵氰化鉀(分析純):成都金山化學(xué)試劑有限公司;三氯乙酸(分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;石油醚、過(guò)氧化氫(均為分析純):天津市富宇精細(xì)化工有限公司;濃鹽酸(分析純):廉江市愛(ài)廉化試劑有限公司;無(wú)水乙醇、甲醇(均為分析純):成都市科隆化學(xué)品有限公司;水楊酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、氯化鈉、氯化鎂(均為分析純):天津博迪化工股份有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        UV-1801紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì):北京瑞利分析儀器有限公司;HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋:江蘇金怡醫(yī)療儀器廠;FA2004N分析天平:上海明橋精密科學(xué)儀器有限公司;TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī):湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;雷磁pH-3C酸度計(jì):上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 圓葉葡萄籽中原花色素提取

        把葡萄籽粉碎后,加一定量的石油醚浸泡脫脂,干燥。以料液比1∶20(g∶mL)加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液超聲波浸提20 min后,50 ℃水浴80 min,得到原花色素提取液,3 000 r/min離心10 min后置于4 ℃條件下保存?zhèn)溆肹13-14]。

        1.3.2 圓葉葡萄籽原花色素的光譜特性

        取一定量的原花色素提取液,用UV-1801紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)350~700 nm范圍內(nèi)測(cè)定其吸光度值,繪制特征吸收光譜。

        1.3.3 原花色素含量的測(cè)定

        采用香草醛-鹽酸法[15]:準(zhǔn)確稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL定容至10 mL。各取1.00 mL(另取1.00 mL甲醇液為空白液)于比色管中,分別加入5.00 mL顯色劑,搖勻后在30 ℃避光水浴30 min,然后測(cè)定A500nm值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程為y=0.773 3x+0.007 2(其中y為吸光度值,x為原花色素質(zhì)量濃度,R2=0.999 1)。

        1.3.4 圓葉葡萄籽原花色素穩(wěn)定性的研究

        溫度對(duì)原花色素穩(wěn)定性的影響:量取一定的原花色素提取液,分別于20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、95 ℃條件下避光保溫,每隔0.5 h取樣冷卻后,測(cè)定其吸光度值。

        pH值對(duì)原花色素穩(wěn)定性的影響:量取一定的原花色素提取液,配制成pH值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的溶液,混勻后室溫避光放置4 h、8 h、12 h、24 h、48 h后,測(cè)其吸光度值。

        金屬離子對(duì)原花色素穩(wěn)定性的影響:量取一定的原花色素提取液,分別加入濃度相等的K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+溶液,混勻后室溫避光放置,設(shè)對(duì)照,按2 h、24 h、48 h取樣測(cè)定其吸光度值。

        還原劑、氧化劑對(duì)原花色素穩(wěn)定性的影響:量取一定的原花色素提取液,分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.5%、1.0%的抗壞血酸溶液和過(guò)氧化氫溶液,混勻后室溫避光放置,設(shè)對(duì)照,每天取樣測(cè)定其吸光度值。

        光照對(duì)原花色素穩(wěn)定性的影響:量取一定的原花色素提取液,置于室內(nèi)避光、室內(nèi)自然光條件下,每5天取樣測(cè)定其吸光度值。

        1.3.5 圓葉葡萄籽原花色素體外抗氧化活性的測(cè)定

        DPPH自由基(DPPH·)清除率的測(cè)定[16]:取不同濃度樣品各0.2 mL倒入試管,加入3.8 mL質(zhì)量濃度為80 mg/L DPPH·的無(wú)水乙醇溶液,搖勻,室溫條件下黑暗處放置30 min,于波長(zhǎng)517 nm處分別測(cè)定吸光度值A(chǔ)i;另取不同濃度樣品各0.1 mL倒入試管,加入3.9 mL無(wú)水乙醇,于波長(zhǎng)517 nm處分別測(cè)定參比吸光度值A(chǔ)b;再取0.1 mL無(wú)水乙醇,加入3.9 mL 80 mg/L的DPPH·無(wú)水乙醇溶液,于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定空白吸光度值A(chǔ)0,計(jì)算DPPH·清除率,其計(jì)算公式如下:

        羥基自由基(·OH)清除率的測(cè)定[16]:取不同濃度樣品各2 mL倒入試管,加入2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液,再加入6 mmol/LH2O2溶液,搖勻,靜置10 min后,加入2 mL 6 mmol/L水楊酸溶液,搖勻,靜置30 min。于波長(zhǎng)510 nm處分別測(cè)定其吸光度值A(chǔ)i;另用蒸餾水代替水楊酸溶液重復(fù)上述試驗(yàn),測(cè)得參比吸光度值A(chǔ)b;另用蒸餾水代替樣品溶液重復(fù)上述試驗(yàn),測(cè)得空白吸光度值A(chǔ)0,計(jì)算·OH清除率,其計(jì)算公式如下:

        還原力(鐵離子還原能力)的測(cè)定[17]:將5 mL原花色素溶液、1 mL、pH 6.6、0.2 mol/L的磷酸鈉緩沖液和1.0 mL 1%的鐵氰化鉀混勻,于50 ℃水浴反應(yīng)20 min后急速冷卻。然后在上述溶液中加入1.0 mL 10%的三氯乙酸溶液,3 000 r/min離心10 min,取上清液2.0 mL。在上清液中加入2.0 mL蒸餾水及0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液,混勻,10 min后于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定其吸光度值。吸光度值越高說(shuō)明樣品的還原能力越強(qiáng)。

        1.3.6 數(shù)據(jù)處理

        采用Office 2010統(tǒng)計(jì)和處理各數(shù)據(jù),試驗(yàn)重復(fù)3次,采用Origin 8.5作圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 圓葉葡萄籽原花色素的光譜特性

        圓葉葡萄籽原花色素在波長(zhǎng)350~700 nm之間有一最大吸收峰,該峰峰值在波長(zhǎng)500 nm處,因此選定500 nm作為最佳吸收波長(zhǎng)。

        2.2 圓葉葡萄籽原花色素穩(wěn)定性的研究

        2.2.1 溫度對(duì)圓葉葡萄籽原花色素穩(wěn)定性的影響

        圖1 溫度對(duì)原花色素穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of temperature on the stability of proanthocyandin

        由圖1可知,溫度為20 ℃、40 ℃、60 ℃時(shí),原花色素溶液吸光度值隨時(shí)間的延長(zhǎng),無(wú)顯著變化。溫度為80 ℃時(shí),其原花色素溶液吸光度值相較于20 ℃、40 ℃、60 ℃緩慢升高,但增幅不大。在95 ℃條件下,隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),原花色素溶液吸光度值則顯著上升,顏色由橘黃色變?yōu)楹稚?,吸光度值明顯變大。這可能是由于高溫條件下葡萄籽原花色素受熱分解為其他物質(zhì)所致[18]。由此可說(shuō)明圓葉葡萄籽原花色素在溫度低于80 ℃時(shí)具有良好的穩(wěn)定性,但更適合于低溫條件下保存和應(yīng)用。

        2.2.2 pH值對(duì)圓葉葡萄籽原花色素穩(wěn)定性的影響

        圖2 pH值對(duì)原花色素穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of pH on the stability of proanthocyandin

        由圖2可知,不同pH對(duì)原花色素的影響差異較大,特別是pH≤3、pH≥9時(shí),原花色素溶液吸光度值隨著時(shí)間的推移而顯著變小,而當(dāng)pH為4~8時(shí),原花色素溶液吸光度值下降不明顯,穩(wěn)定性較好。由此可見(jiàn),酸性或堿性過(guò)強(qiáng)都會(huì)破壞原花色素的結(jié)構(gòu),在弱酸、弱堿性(pH4~8)條件下其相對(duì)比較穩(wěn)定。

        2.2.3 金屬離子對(duì)圓葉葡萄籽原花色素穩(wěn)定性的影響

        圖3 金屬離子對(duì)原花色素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of metal ions on the stability of proanthocyandin

        由圖3可知,在含有K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+金屬離子的溶液中,原花色素的吸光度值隨時(shí)間變化不明顯,與對(duì)照組變化相似,對(duì)原花色素穩(wěn)定性影響不大。而當(dāng)原花色素遇Cu2+時(shí),溶液顏色立刻轉(zhuǎn)變?yōu)樽鼐G色,吸光度值明顯減小;加入Fe3+后溶液顏色立刻轉(zhuǎn)為綠褐色,并帶有輕微渾濁現(xiàn)象,吸光度值減小,常溫放置24 h后有絮狀沉淀產(chǎn)生。由此可以看出Cu2+、Fe3+對(duì)原花色素有明顯的破壞作用。

        2.2.4 還原劑、氧化劑對(duì)原花色素穩(wěn)定性的影響

        圖4 抗壞血酸對(duì)原花色素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of ascorbic acid on the stability of proanthocyandin

        由圖4可知,與對(duì)照相比,抗壞血酸對(duì)原花色素的影響不明顯。0.1%抗壞血酸對(duì)原花色素幾乎無(wú)影響,而0.5%和1%抗壞血酸隨著時(shí)間的延長(zhǎng),引起原花色素溶液吸光度值小幅下降。因此,還原劑抗壞血酸對(duì)圓葉葡萄籽中原花色素?zé)o明顯的破壞作用。

        由圖5可知,與對(duì)照相比,0.1%與0.5%過(guò)氧化氫溶液對(duì)原花色素穩(wěn)定性影響較小,而1.0%過(guò)氧化氫溶液對(duì)原花色素影響較大,吸光度值明顯下降,表明氧化劑濃度越高,對(duì)原花色素溶液破壞越大。

        圖5 過(guò)氧化氫對(duì)原花色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of hydrogen peroxide on the stability of proanthocyandin

        2.2.5 光照對(duì)圓葉葡萄籽原花色素穩(wěn)定性的影響

        圖6 光照對(duì)原花色素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of light on the stability of proanthocyandin

        由圖6可知,在室溫條件下,圓葉葡萄籽原花色素易受光照影響,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),原花色素的吸光度值逐漸下降。避光條件下原花色素的穩(wěn)定性明顯較好,其降解速度較慢,在使用和保存時(shí)應(yīng)該避光處理。

        2.3 圓葉葡萄籽原花色素體外抗氧化活性分析

        2.3.1 圓葉葡萄籽原花色素對(duì)DPPH·的清除作用

        原花色素分子中含有大量的酚羥基,使其具有強(qiáng)大的抗氧化和自由基清除能力[19]。

        圖7 原花色素對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of proanthocyandin on DPPH free radical

        由圖7可知,當(dāng)原花色素溶液質(zhì)量濃度在0.01~0.1mg/mL范圍內(nèi),圓葉葡萄籽原花色素對(duì)DPPH自由基具有清除作用,隨著原花色素質(zhì)量濃度的增加,DPPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng),并且在原花色素用量很低的情況下,清除率仍可高達(dá)90%以上,由此得出,葡萄籽原花色素具備一定的清除DPPH自由基的能力。

        2.3.2 圓葉葡萄籽原花色素對(duì)·OH的清除作用

        H2O2與Fe2+反應(yīng)生成的羥基自由基能與水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì),可由溶液顏色的變化程度,來(lái)評(píng)價(jià)原花色素物質(zhì)抗氧化活性的高低[20]。

        圖8 原花色素對(duì)·OH的清除作用Fig.8 Scavenging effect of proanthocyandin on hydroxyl radical

        由圖8可知,在選定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),原花色素溶液對(duì)羥基自由基有較好的清除作用,其清除效果與原花色素溶液的添加量呈正相關(guān)。當(dāng)原花色素質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí),其清除率達(dá)到59.12%。葡萄籽原花色素具備一定的清除羥基自由基的能力。

        2.3.3 圓葉葡萄籽原花色素的鐵離子還原能力

        圖9 原花色素的鐵離子還原能力Fig.9 Iron reducing power of proanthocyandin

        由圖9可知,圓葉葡萄籽原花色素具有一定的還原能力,當(dāng)質(zhì)量濃度<0.08 mg/mL時(shí),隨質(zhì)量濃度增加,吸光度值增加幅度明顯,原花色素還原力逐漸增強(qiáng),還原能力顯示出一定的量效關(guān)系;當(dāng)質(zhì)量濃度>0.08 mg/mL時(shí),隨質(zhì)量濃度增大,吸光度值變化趨緩,原花色素還原能力增加緩慢。

        3 結(jié)論

        通過(guò)溫度、pH、金屬離子、氧化劑還原劑、光照五個(gè)因素對(duì)圓葉葡萄籽原花色素的穩(wěn)定性影響進(jìn)行研究,結(jié)果表明,圓葉葡萄籽原花色素在溫度低于80 ℃時(shí)具有良好的穩(wěn)定性,pH 4~8范圍內(nèi)該原花色素較穩(wěn)定;金屬離子K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+對(duì)原花色素的穩(wěn)定性影響不明顯,而Cu2+、Fe3+有明顯的破壞作用;抗壞血酸對(duì)原花色素?zé)o明顯影響,過(guò)氧化氫則顯著降低其穩(wěn)定性;較長(zhǎng)時(shí)間的光照對(duì)其穩(wěn)定性不利。抗氧化試驗(yàn)表明,圓葉葡萄原花色素對(duì)DPPH·、·OH有明顯的清除效果,并具有一定的還原能力。

        綜上,圓葉葡萄籽原花色素的加工儲(chǔ)藏過(guò)程中應(yīng)在避光、低溫、弱酸環(huán)境中進(jìn)行,并應(yīng)避免與氧化劑及鐵、銅器皿的接觸。

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