史巧霞 靳子明 張巖

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州730000

過(guò)量飲酒會(huì)導(dǎo)致嘔吐惡心等，嚴(yán)重時(shí)甚至可因呼吸肌麻痹而導(dǎo)致死亡［1］。劉麒［2］等研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者血壓會(huì)隨著酗酒量的增加而升高；楊家紅［3］等研究表明胃癌等惡性疾病與過(guò)量飲酒有著直接聯(lián)系；范建高等［4］研究發(fā)現(xiàn)少量或適量飲酒能夠降低膽固醇水平、減少胰島素抵抗，可以降低代謝綜合征的發(fā)生，最終導(dǎo)致人體代謝綜合征的發(fā)生。由葛根、人參等九味中藥組成的解酒保肝方，在廣泛使用后療效可靠。方中葛根、人參具有生津止渴、利水消腫、防酒毒傷脾等作用，合用助解酒與扶正；蜂蜜調(diào)和諸藥、兼以解酒護(hù)肝。全方具有益氣扶正、生津止渴、解毒去濕之功效。由于本處方中藥材大多數(shù)含有豐富的黃酮類(lèi)成分，因此選用總黃酮作用評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交實(shí)驗(yàn)確定最佳提取條件，建立穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝。建立口服液的薄層色譜鑒別成分，進(jìn)一步制備出療效快、劑量準(zhǔn)確、生物利用度高、易于規(guī)模化生產(chǎn)的口服液。

1 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑與藥材

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑UV-3300型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美普達(dá)儀器有限公司）、KERN-ABJ型電子分析天平（上海實(shí)驗(yàn)器材有限公司）、YLA-2000型真空干燥箱（龍口市先科儀器公司）。蘆丁對(duì)照品（上海源葉生物有限公司，批號(hào)：B20771）、硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥材 甘肅天士力中天藥業(yè)有限責(zé)任公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 解酒保肝口服液制備工藝研究 結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)條件，解酒保肝口服液的制備主要采用水提法。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察提取時(shí)間、料液比值、提取次數(shù)與總黃酮含量的關(guān)系，優(yōu)化水提條件，確定最佳工藝。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備。首先取蘆丁對(duì)照品9.1mg，添補(bǔ)甲醇至25mL容量瓶中定容，得到對(duì)照品溶液。按等量遞增取配好的蘆丁溶液各0mL、1.0mL、2.0mL、3.0 mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL，移取到25mL容量瓶中，先用移液槍加5%的硝酸鈉溶液1.0mL，搖勻后再加10%的硝酸鋁溶液1.0mL，最后加4%的氫氧化鈉溶液10.0 mL，添補(bǔ)甲醇到刻度25mL容量瓶的刻度線(xiàn)。設(shè)置紫外分光光度計(jì)的波長(zhǎng)為510 nm，顯示A值并記錄。計(jì)算回歸曲線(xiàn)時(shí)以濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，得到回歸方程為y=12.792X-0.0052，R2=0.9996，表明蘆丁在0~0.08736 mg/mL濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

2.1.2 水提工藝正交試驗(yàn)。①供試品溶液的制備：以提取時(shí)間、料液比值、提取次數(shù)三個(gè)因素，參照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法得到解酒保肝口服液水提工藝的L9（33）正交試驗(yàn)因素水平表。見(jiàn)表1。按正交設(shè)計(jì)表制備9份生藥量為0.5mg/mL的解酒保肝口服液，分裝在口服液瓶中，備用。②總黃酮含量測(cè)定：取9份上述正交設(shè)計(jì)得到的解酒保肝口服液各0.1mL于2mL容量瓶中，按“2.1.1”項(xiàng)下加硝酸鈉溶液，氫氧化鈉等反應(yīng)試劑，添補(bǔ)甲醇定容。在510nm波長(zhǎng)處記錄A值，代入回歸方程計(jì)算總黃酮含量。見(jiàn)表2。

表1 水提工藝L9（33）正交試驗(yàn)因素水平表

表2 解酒保肝口服液制備工藝參數(shù)確定正交試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 水提工藝實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表3結(jié)果表明各因素對(duì)水提液中總黃酮含量影響的大小順序?yàn)樘崛〈螖?shù)最大，提取時(shí)間次之，料液比值影響最小。由正交試驗(yàn)可得理論上最佳工藝為A3B3C3，但考慮到生產(chǎn)周期與成本，最終確定解酒保肝口服液的最佳提取條件為A2B2C2，即加15倍量水提取1 h，共提取2次。根據(jù)最佳工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到總黃酮的平均含量為12.75 mg/mL，其RSD值為0.85%，小于1%，證明解酒保肝口服液選用以上最終提取工藝穩(wěn)定可靠，可以為后續(xù)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

表3 方差分析表

2.2 解酒保肝口服液的薄層色譜鑒別

2.2.1 葛根色譜鑒別。取正交設(shè)計(jì)得到的解酒保肝口服液5mL水浴揮干，殘?jiān)眉状汲s后揮干，再添補(bǔ)甲醇至1mL容量瓶，備用。然后再取葛根素對(duì)照品1mg，添補(bǔ)甲醇至1mL容量瓶里，備用。后面再將處方中的葛根藥材去除，將其余藥材煎煮后制成缺葛根的陰性口服液樣品。展開(kāi)時(shí)用三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）的展開(kāi)劑，倒入展開(kāi)缸里先飽和15min；飽和后將點(diǎn)好的薄層板放進(jìn)展開(kāi)缸，展至距薄層板最上邊緣2cm時(shí)停止展開(kāi)，取出薄層板，晾干后置氨蒸氣中熏15 min顯色；顯色后在紫外光燈（365nm）下檢視斑點(diǎn)。見(jiàn)圖2。在與供試品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，分別顯相同的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無(wú)明顯斑點(diǎn)顯現(xiàn)。

2.2.2 人參色譜鑒別。參照藥典［5］，取正交設(shè)計(jì)得到的解酒保肝口服液5mL水浴揮干，殘?jiān)萌燃淄榛亓?h后揮干，加少量水濕潤(rùn)殘?jiān)盟柡驼〈汲曁幚?，使充分溶解，靜置后吸取上清液，加3倍量氨試液，充分搖勻，放置分層，取上層液蒸干，再得殘?jiān)?，將殘?jiān)D(zhuǎn)移至1mL容量瓶中，用1mL甲醇定容，作為供試品溶液。另取人參對(duì)照藥材1g，同法制成人參對(duì)照藥材溶液。將處方中的人參藥材去掉，其余藥材按比例制成缺人參的陰性口服液樣品。再參照供試品溶液的制法，制成陰性對(duì)照溶液。毛細(xì)管吸取上述3種溶液點(diǎn)于同一硅膠G板上，展開(kāi)劑選用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置的下層溶液。將展開(kāi)劑提前倒入展開(kāi)缸飽和。飽和后再放入點(diǎn)好樣的薄層板，展至距薄層板最上邊緣2cm時(shí)停止展開(kāi)取出，晾干后用顯色瓶噴10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在日光和紫外燈下（365nm）下觀察斑點(diǎn)。見(jiàn)圖2。在與供試品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，分別顯相同的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品有斑點(diǎn)顯現(xiàn)，但與供試品和對(duì)照藥材斑點(diǎn)均不在同一位置。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以總黃酮的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)解酒保肝口服液的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，影響解酒保肝口服液的提取因素大小順序?yàn)樘崛〈螖?shù)＞提取時(shí)間＞料液比值，最終結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)確定其最佳提取工藝為A2B2C2，即15倍量水煎煮2次，每次1h。根據(jù)正交設(shè)計(jì)表可看出，其理論上最佳提取條件為20倍量水提取3次，每次1.5h，但該條件下提取液體積較大，再結(jié)合生產(chǎn)周期與成本考慮舍棄該條件。本處方中枳椇子、葛根、葛花、紅芪等均含有豐富的黃酮類(lèi)化合物，其中以君藥枳椇子含量居多?？傸S酮是植物次生代謝產(chǎn)物，在植物中廣泛存在，以游離態(tài)或與糖結(jié)合為苷的形式存在，研究表明，總黃酮類(lèi)化合物具有降血糖、抗炎抗菌、抗氧化抗腫瘤等多種藥理作用［6-9］，因此本研究以黃酮類(lèi)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，具有較大的考察意義。

圖2 葛根、人參藥材薄層色譜圖

解酒保肝口服液的薄層色譜中，供試品與葛根對(duì)照藥材在相對(duì)應(yīng)的位置上顯現(xiàn)出相同的斑點(diǎn)，葛根陰性對(duì)照中無(wú)明顯斑點(diǎn)出現(xiàn)。其供試品與人參對(duì)照藥材也在相對(duì)應(yīng)的位置上顯現(xiàn)相同的斑點(diǎn)，人參陰性對(duì)照藥材中有斑點(diǎn)顯現(xiàn)，但與供試品和對(duì)照藥材斑點(diǎn)均不在相同位置。因此，本研究為解酒保肝口服液的合理開(kāi)發(fā)利用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。