張 軍,袁 祥,張李成,胡 曄,楊慶雄*

(1.貴州師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550001;2.貴州師范大學(xué)喀斯特學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550001)

小葉苦丁茶為木犀科女貞屬植物粗壯女貞的葉,是貴州、云南、四川等西南地區(qū)常用的飲料植物,應(yīng)用廣泛,含有多種化學(xué)成分,并具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤轉(zhuǎn)移、肝保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、心血管保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)[1-9]等多種藥理活性。其中,含有量較高的阿克苷,紫莖女貞苷A被認(rèn)為是小葉苦丁茶主要活性成分[9-11],He 等[12]用95%乙醇提取苦丁茶,再以D101 大孔吸附樹(shù)脂、硅膠、Lichroprep RP-18 為填料,用水、氯仿-甲醇-水反復(fù)洗脫分離得到兩者,但分離流程較長(zhǎng)。

阿克苷作為多種植物的有效成分,制備分離方法較多,如Li 等[13]用硅膠柱、Sephadex LH-20 凝膠柱結(jié)合高速逆流色譜(HSCCC),從車(chē)前草中分離得到該成分；Lei 等[14]用75%乙醇提取肉蓯蓉,再用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取提取物,最后以HSCCC 從正丁醇部位中分離得到該成分。阿克苷、紫莖女貞苷A 極性相近,常用硅膠柱色譜、反相硅膠柱色譜、HPLC 制備色譜等方法進(jìn)行分離純化,但過(guò)程繁瑣,成本較高,尚無(wú)快速同時(shí)分離兩者的報(bào)道。

因此,本實(shí)驗(yàn)采用大孔吸附樹(shù)脂結(jié)合HSCCC,簡(jiǎn)潔、快速地分離小葉苦丁茶中阿克苷、紫莖女貞苷A,以期為后期該藥材的深入研究和開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 小葉苦丁茶采自貴州省余慶縣,經(jīng)貴州師范大學(xué)楊慶雄教授鑒定為正品。HP-20 大孔吸附樹(shù)脂(日本三菱化學(xué)公司)。色譜純乙腈、甲醇(德國(guó)默克公司)；分析純甲醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲酸(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。

1.2 儀器 TBE-300C 型高速逆流色譜儀(上海同田生物技術(shù)股份有限公司)；LC-30AD 高效液相色譜儀 (配置SPD-M30A 二極管陣列檢測(cè)器)、LCMS-2020 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)；N-1300 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本Eyela 公司)；T-214 型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京) 有限公司]。

2 方法

2.1 藥材提取和大孔吸附樹(shù)脂快速分段 取藥材干燥葉3 kg,粉碎、冷水浸泡3 次(共20 L),每次12 h,將3 次浸取液合并過(guò)濾,濾液減壓濃縮至5 L,取100 mL,減壓濃縮除去溶劑待用,剩余濾液按料液比1∶1 上HP-20 非極性大孔吸附樹(shù)脂,依次用水、50% 甲醇、甲醇梯度洗脫,每個(gè)梯度4 個(gè)柱體積,收集50%甲醇、甲醇洗脫部位,減壓濃縮除去溶劑,得到相應(yīng)部位(褐色粉末)。

2.2 HPLC 條件 Phenomenex ODS 色譜柱 (250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相水(含0.1%甲酸) (A) -乙腈(B),梯度洗脫(0～14 min,16%～18% B；14～27 min,18% B；27～40 min,18%～40%B；40～50 min,40%～100%B；50～55 min,100%B)；體積流量0.7 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm。

2.3 HPLC-MS 條件

2.3.1 HPLC Phenomenex ODS 色譜柱 (150 mm ×4.6 mm)；流動(dòng)相水(含0.1%甲酸) (A) -乙腈(B),梯度洗脫(0～14 min,16%～18% B；14～30 min,18% B；30～35 min,100%B)；體積流量0.5 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm。

2.3.2 MS 測(cè)定時(shí)間0～35 min；正負(fù)離子分析模式,掃描范圍m/z 200～800；掃描速度1 250 u/s；霧化氣體積流量1.5 L/min；加熱塊溫度 400 ℃；干燥氣 體積流量15 L/min。

2.4 HSCCC 溶劑系統(tǒng)篩選 根據(jù)目標(biāo)化合物性質(zhì)結(jié)合文獻(xiàn)[15-20]確定溶劑系統(tǒng)。將對(duì)應(yīng)比例的溶劑加入到分液漏斗中,上下充分振搖,靜置后分液,稱取分離樣品約1 mg,精密量取上相、下相溶液各1 mL 將其溶解,充分振蕩溶解,待兩相平衡后再分別精密量取0.2 mL,揮干,1 mL甲醇溶解,進(jìn)行HPLC 分析,計(jì)算不同溶劑系統(tǒng)中目標(biāo)化合物的分配系數(shù)K,公式為K=目標(biāo)化合物在上相溶液中的峰面積/目標(biāo)化合物在下相溶液中的峰面積。

2.5 HSCCC 分離過(guò)程與方法 將上相、下相溶劑系統(tǒng)分液,超聲處理15 min,各取5 mL,再取待分離樣品約200 mg溶于其中,充分搖勻,靜置分層(準(zhǔn)備5 份樣品連續(xù)進(jìn)樣)。以上相為固定相,下相為流動(dòng)相,將泵體積流量設(shè)為40 mL/min,泵入上相溶劑至充滿儀器后停泵,啟動(dòng)主機(jī),將轉(zhuǎn)速設(shè)為850 r/min,體積流量調(diào)為10 mL/min,泵入下相溶劑,待上相、下相溶劑同時(shí)流出且平衡后,計(jì)算保留率,公式為保留率=[(400-平衡后流出的上相體積)/370]×100%,從樣品注射口加入用上相、下相溶解的樣品,設(shè)定色譜檢測(cè)波長(zhǎng)313 nm,溫度25 ℃,當(dāng)上一針樣品幾乎完全流出時(shí)不停機(jī),連續(xù)再次進(jìn)樣,按出峰收集分段。

3 結(jié)果

3.1 大孔吸附樹(shù)脂分段 3 kg 藥材干燥葉經(jīng)水提取、大孔吸附樹(shù)脂分段、蒸干收集洗脫大孔吸附樹(shù)脂后,得到50%甲醇洗脫部位187 g、甲醇洗脫部位66 g,可知藥材能被樹(shù)脂吸附的組分主要集中在50%甲醇洗脫部位中,但小極性的甲醇洗脫部位也有約1/3 的量。取“2.1” 項(xiàng)下中未經(jīng)樹(shù)脂處理的水提物及50%甲醇、甲醇部分洗脫部位各4 mg,溶于1 mL 甲醇中,在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣2 μL,歸一化法計(jì)算峰面積,結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知,水提物中紫莖女貞苷A 占總量的24%,阿克苷占9%,經(jīng)樹(shù)脂處理后兩者分別占42%、20%,并主要富集在50%甲醇洗脫部位,再用甲醇洗脫后基本檢測(cè)不到兩者。

3.2 HSCCC 溶劑系統(tǒng)篩選 根據(jù)文獻(xiàn)[15-20]報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)考察了氯仿-甲醇-水、乙酸乙酯-正丁醇-水,發(fā)現(xiàn)前者按4∶3∶2、5∶3∶2、4∶1∶5 比例洗脫時(shí),阿克苷K 值分別為65、132、1.45,而紫莖女貞苷A 分別為113、212、0.33；后者按4∶0.6∶5、5∶2∶5、4∶3∶4 比例洗脫時(shí),2 種成分K 值分別為1.07、3.6、5.71,0.18、0.98、1.7。由此可知,以乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶2∶5) 洗脫時(shí),阿克苷、紫莖女貞苷A 的分離度(兩者K 值的比值) 為3.67,可較好地從混合體系中分離出來(lái),故選擇其作為溶劑系統(tǒng)。

圖1 2 種成分HPLC 色譜圖

3.3 HSCCC 分離 用乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶2∶5) 分離“2.1” 項(xiàng)下50%甲醇洗脫部分,按“2.5” 項(xiàng)下方法進(jìn)樣200 mg,結(jié)果見(jiàn)圖2,可知各色譜峰分離度較好,固定相保留率為54%。取分離得到的Ⅰ號(hào)峰、Ⅱ號(hào)峰物質(zhì),在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定,并與圖1B 進(jìn)行對(duì)比,確定兩者均為目標(biāo)分離物。再將50%甲醇洗脫部位連續(xù)進(jìn)樣5 次,每次200 mg,結(jié)果見(jiàn)圖3,可知HSCCC 中目標(biāo)峰分離度仍良好。1 g 樣品經(jīng)500 min 分析后,得Ⅰ號(hào)峰265 mg,得率26.5%；Ⅱ號(hào)峰300 mg,得率30.0%,面積歸一法測(cè)得兩者純度分別為96.5%、98%。

圖2 50%甲醇洗脫部位單次進(jìn)樣HSCCC 分離情況

圖3 50%甲醇洗脫部位連續(xù)進(jìn)樣HSCCC 分離情況

3.4 化合物鑒定 通過(guò)HPLC-MS 將Ⅰ號(hào)、Ⅱ號(hào)峰化合物與相應(yīng)對(duì)照品進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)前者與紫莖女貞苷A 保留時(shí)間、紫外圖譜、相對(duì)分子質(zhì)量一致,后者與阿克苷保留時(shí)間、紫外圖譜、相對(duì)分子質(zhì)量一致。由此可知,2 個(gè)化合物分別為紫莖女貞苷A、阿克苷。

4 討論

小葉苦丁茶水提取物經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附后,不僅可除去糖類等大極性水溶性組分,而且能通過(guò)調(diào)節(jié)洗脫劑中甲醇體積分?jǐn)?shù),在50%時(shí)將目標(biāo)分子完全洗脫下來(lái),同時(shí)也除去了極性較小、在樹(shù)脂柱上吸附較強(qiáng)的其他組分,達(dá)到了較好的預(yù)分離富集作用,并且該方法簡(jiǎn)便快速,成本低廉。在HSCCC 分離過(guò)程中采取單次進(jìn)樣,若進(jìn)樣量過(guò)大,則各物質(zhì)的出峰分離度會(huì)降低,產(chǎn)物純度也不足,但可在不重新灌注新固定相的情況下反復(fù)多次進(jìn)樣,采用相同色譜條件時(shí)分離效果可有效保持。本實(shí)驗(yàn)取200 mg 進(jìn)樣5 次,發(fā)現(xiàn)色譜峰基本保持相同的分離效果,可用于快速大量制備分離紫莖女貞苷A、阿克苷,無(wú)需停機(jī)、清洗、平衡,分離效率明顯,而且5 次進(jìn)樣分離后由于固定相保留良好,還能繼續(xù)使用,可見(jiàn)HSCCC 法可作為大量制備的基礎(chǔ),增加其規(guī)格時(shí)能較方便地放大規(guī)模。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在快速大量分離小葉苦丁茶中阿克苷、紫莖女貞苷A 時(shí),首先以大孔吸附樹(shù)脂對(duì)其水提物進(jìn)行梯度洗脫分段,發(fā)現(xiàn)上述2 種成分能大量富集于50%甲醇部位,再選擇乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶2∶5) 作為HSCCC 的分離體系,并且在分離過(guò)程中采用不停機(jī)、多次少量連續(xù)進(jìn)樣的方法,可減小儀器負(fù)載,提高出峰成分分離度。結(jié)果顯示,該方法穩(wěn)定方便,能得到純度較高阿克苷、紫莖女貞苷A,并且分離時(shí)間短,能很好地提高制備效率。由于連續(xù)進(jìn)樣5 次能得到穩(wěn)定的分離效果,故今后研究可在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行多次進(jìn)樣,從而進(jìn)行更大量的分離。