張曉蕾 郭明里 黃 茜龔云麒李 寧*陳云建*張建文楊兆祥

(1.昆藥集團(tuán)股份有限公司,云南 昆明 650100;2.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,云南 昆明 650500;3.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院,云南 大理 671000)

曲札茋苷(白皮杉醇-3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷) 是從我國(guó)西藏特有植物拉薩大黃Rheum lhasaense A.J.Li et P.K.Hsiao 中提取得到的活性成分[1-2],為茋苷(二苯乙烯苷)類化合物,其結(jié)構(gòu)中2 個(gè)苯環(huán)之間存在1 個(gè)雙鍵,故理論上存在順式、反式2 種異構(gòu)體(圖1)。由于反式異構(gòu)體在熱力學(xué)上較順式穩(wěn)定,以往研究中獲得的均為前者,故不考慮構(gòu)型,以曲札茋苷指代反式曲札茋苷。

圖1 順式、反式曲札茋苷結(jié)構(gòu)

研究表明,曲札茋苷在心腦血管[2-3]、神經(jīng)系統(tǒng)[4]、呼吸系統(tǒng)[5]、消化系統(tǒng)[6]、腫瘤[7]等諸多重大疾病領(lǐng)域中有著廣闊的應(yīng)用前景。昆藥集團(tuán)股份有限公司對(duì)其進(jìn)行了持續(xù)的考察,在云南麗江引種栽培了拉薩大黃[8],對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究[9],建立了該藥材中曲札茋苷的工業(yè)化提取純化工藝[10],可大規(guī)模制備純度98%以上者[11]。同時(shí),在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了注射用曲札茋苷,以期形成具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的天然創(chuàng)新藥物。

雜質(zhì)是藥物質(zhì)量研究的重要組成部分,注射用曲札茋苷中該類成分能否被全面、準(zhǔn)確地控制直接關(guān)系到其有效性與安全性。前期發(fā)現(xiàn),注射用曲札茋苷中的雜質(zhì)大部分是拉薩大黃原有成分,隨著工藝過(guò)程進(jìn)入成品,但有少量并非來(lái)源于原藥材。在工藝及貯存過(guò)程中,經(jīng)強(qiáng)烈日光照射后的原料藥、中間體、制劑中反式曲札茋苷含有量明顯降低,雜質(zhì)譜也發(fā)生較大的變化。理論上,光照可誘導(dǎo)二苯乙烯類化合物順?lè)串悩?gòu)化,電子首先受光照從基態(tài)激發(fā)到激發(fā)態(tài),再經(jīng)過(guò)無(wú)輻射躍遷返回分子基態(tài),導(dǎo)致分子可從反式轉(zhuǎn)化為順式,或從順式變?yōu)榉词絒12],故順式曲札茋苷是注射用曲札茋苷中潛在的雜質(zhì)。

近年來(lái),有采用光化學(xué)反應(yīng)制備高純度二苯乙烯苷類化合物順式異構(gòu)體的研究[13],但尚無(wú)關(guān)于順式曲札茋苷的報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)光化學(xué)反應(yīng)將反式曲札茋苷轉(zhuǎn)化為順式后,對(duì)其進(jìn)行分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定,并考察其熱穩(wěn)定性及抗凝血酶活性,以期為進(jìn)一步相關(guān)研發(fā)提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀(配置在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、VWD 檢測(cè)器)、Agilent QTOF 6540 質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；Avance 800 MHz 核磁共振儀(德國(guó)Bruker 公司)；CP225D 分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；XPE26 分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Milli-Q 超純水機(jī)(美國(guó)Millipore 公司)；ZF-6 紫外燈(上海嘉鵬科技有限公司)；Buchi R-3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；ED-IE-50 凍干機(jī)(上海比郎儀器有限公司)；HS-25 PH 計(jì)(丹佛儀器有限公司)；Synergy HT 酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek 公司)；IMS-70 全自動(dòng)雪花制冰機(jī)(常熟市雪科電器有限公司)；Eppendorf 移液器(德國(guó)Sartorius 公司)。

1.2 試劑與藥物 反式曲札茋苷對(duì)照品(純度≥99.0%)及原料藥(批號(hào)20140104、20140104-UV-1、20140104-UV-2、20140104-UV-3) (昆藥集團(tuán)股份有限公司自制)。人凝血酶 (美國(guó)Hyphen 公司,Vial of 10 NIH)；熒光底物thrombin substrate 2 (FR-2) Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC (加拿大Biomatik 公司)。阿加曲班(湖北鑫源順醫(yī)藥化工有限公司,純度≥99%)。色譜純乙腈(德國(guó)默克公司)；色譜純乙醇(賽默飛世爾科技有限公司)；氘代甲醇(美國(guó)Sigma-Aldrich 公司)；三羥甲基氨基甲烷(Tris,美國(guó)Amresco 公司,純度≥99.9%)；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 順式曲札茋苷制備 稱取反式曲札茋苷對(duì)照品150 mg,置于200 mL 玻璃燒杯中,加入100 mL 甲醇充分溶解,將燒杯敞口置于紫外燈下,以365 nm 紫外光照射4 h,反應(yīng)后的溶液在35 ℃以下減壓濃縮至2 mL,濃縮液通過(guò)HPLC 法分離純化。色譜條件為Phenomenex Luna Su C18(2)色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相95%乙醇-水(30∶70)；柱溫20 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)319 nm；進(jìn)樣量50 μL；目標(biāo)峰(順式曲札茋苷) 保留時(shí)間約16 min。收集目標(biāo)峰洗脫液,立即以氮?dú)獯祾邠]去乙醇,于黑暗環(huán)境中冷凍干燥,合并凍干粉,即得(20 mg)。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 順式曲札茋 白色粉末(乙醇-水),溶于甲醇、乙醇、乙腈中。UV (乙腈-水) λmax:285 nm。HRESI-MS m/z:405.119 8[M-H]-(計(jì)算值405.119 1),分子式C20H22O9。1HNMR (800 MHz,CD3OD) δ:7.21 (1H,d,J=1.6 Hz,H-2′),6.81 (1H,dd,J=8.0,1.6 Hz,H-6′),6.72 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.39 (1H,d,J=12.0 Hz,H-β),6.34(1H,d,J=12.0 Hz,H-α),6.24 (2H,d,J=1.6 Hz,H-2,6),6.14 (1H,t,J=1.6 Hz,H-4),4.47 (1H,d,J=7.2 Hz,H-1″),3.72 (1H,dd,J=12.0,3.2 Hz,H-6″a),3.60(1H,dd,J=12.0,2.4 Hz,H-6″b),3.49 (1H,m,H-2″),3.41 (2H,m,H-3″,5″),3.10 (1H,m,H-4″)；13C-NMR(200 MHz,CD3OD) δ:141.3 (C-1),108.2 (C-2,6),159.5 (C-3,5),102.6 (C-4),130.7 (C-1′),116.5 (C-2′),146.4 (C-3′),147.4 (C-4′),118.4 (C-5′),126.1 (C-6′),129.4 (C-α),130.3 (C-β),104.3 (C-1″),74.8 (C-2″),77.4 (C-3″),70.4 (C-4″),77.4 (C-5″),61.6 (C-6″)。

2.2.2 反式曲札茋 淡黃色粉末(乙醇-水),溶于甲醇、乙醇、乙腈中。UV (乙腈-水) λmax:319 nm。HRESI-MS m/z:405.119 3 [M-H]-(計(jì)算值405.119 1),分子式C20H22O9。1H-NMR (800 MHz,CD3OD) δ:7.45 (1H,d,J=1.6 Hz,H-2′),7.06 (1H,dd,J=8.0,1.6 Hz,H-6′),6.81 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.93 (1H,d,J=16.0 Hz,H-β),6.84 (1H,d,J=16.0 Hz,H-α),6.45 (2H,d,J=2.4 Hz,H-2,6),6.16 (1H,t,J=2.4 Hz,H-4),4.80(1H,d,J=7.2 Hz,H-1″),3.95 (1H,dd,J=12.0,2.4 Hz,H-6″a),3.73 (1H,dd,J=12.0,5.6 Hz,H-6″b),3.51(1H,m,H-2″),3.49 (2H,m,H-3″,5″),3.39 (1H,t,J=8.8 Hz,H-4″)；13C-NMR (200 MHz,CD3OD) δ:141.6 (C-1),106.4 (C-2,6),160.1 (C-3,5),103.3 (C-4),131.8(C-1′),117.1 (C-2′),147.5 (C-3′),148.7 (C-4′),117.7(C-5′),124.1 (C-6′),128.4 (C-α),129.6 (C-β),105.0(C-1″),75.5 (C-2″),78.1 (C-3″),72.0 (C-4″),79.0 (C-5″),63.1 (C-6″)。

2.2.3 數(shù)據(jù)歸屬 通過(guò)DEPT、HSQC、HMBC、1D-TOCSY等核磁共振實(shí)驗(yàn)對(duì)反式曲札茋的1H-NMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)進(jìn)行歸屬,主要HMBC 相關(guān)見(jiàn)圖2。順式曲札茋苷的核磁數(shù)據(jù)與反式曲札茋苷的相似,主要區(qū)別在于前者1H-NMR 中δ 6.34、6.39 可見(jiàn)1 對(duì)相互偶合的烯氫信號(hào),偶合常數(shù)為12.0 Hz,提示雙鍵構(gòu)型為順式,參照反式曲札茋核磁數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)[14]中類似結(jié)構(gòu)的化合物,對(duì)該成分1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸屬,經(jīng)文獻(xiàn)檢索可知它為首次獲得,而且是新化合物。

圖2 反式曲扎茋苷主要HMBC 相關(guān)

2.3 順式曲札茋苷含有量測(cè)定及其熱穩(wěn)定性研究 精密稱取“2.1” 項(xiàng)下樣品適量,甲醇制成40 μg/mL 溶液,即得供試品溶液；精密稱取反式曲札茋苷對(duì)照品適量,甲醇制成40 μg/mL 溶液,即得對(duì)照品溶液。色譜條件為Grace Apollo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A) -0.1%磷酸(B),梯度洗脫(0～25 min,15%～30%A；25～30 min,30%～40% A；30～35 min,40%～15% A；35～40 min,15% A)；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)319 nm；進(jìn)樣量10 μL。

取“2.1” 項(xiàng)下樣品適量,于溫度25 ℃、相對(duì)濕度60%環(huán)境中貯存,于0、24 h 在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得順式曲札茋苷純度分別為97.1%、84.2%,表明該成分穩(wěn)定性較差。

取避光保存(批號(hào)20140104) 及經(jīng)強(qiáng)烈日光照射過(guò)(批號(hào) 20140104-UV-1、20140104-UV-2、20140104-UV-3,分別于約100 000 lx 日光下直射約1 h、15 min、5 min) 的反式曲札茋苷原料藥進(jìn)行測(cè)定,色譜圖見(jiàn)圖3。結(jié)果,避光保存的原料藥中順式曲札茋苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.18%,而3 批經(jīng)強(qiáng)烈日光照射者分別為33.15%、9.16%、4.12%,表明光照會(huì)誘導(dǎo)反式曲札茋苷異構(gòu)化,增加順式曲札茋苷雜質(zhì)含有量。

圖3 供試品溶液（經(jīng)強(qiáng)烈日光照射過(guò)的） 中2 種成分HPLC 色譜圖

取原料藥(批號(hào)20140104-UV-2) 2 份,25%乙醇制成0.5 mg/mL 溶液,分別置于80、100 ℃水浴中加熱1 h,減壓蒸干,測(cè)得順式曲札茋苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.69%、0.77%。由此表明,加熱會(huì)促進(jìn)順式曲札茋苷轉(zhuǎn)為反式,而且溫度越高,轉(zhuǎn)化率越高,同時(shí)提高反式曲札茋苷純度。

2.4 順式曲札茋苷抗凝血活性研究 參考文獻(xiàn) [15]報(bào)道。

2.4.1 Tris-NaCl 緩沖液制備 稱取Tris 適量,加入NaCl適量后用水溶解,濃HCl 調(diào)節(jié)pH 至8.40,即得(含Tris 0.05 mol/L、NaCl 0.3 mol/L),在4 ℃下保存。

2.4.2 熒光底物溶液制備 稱取Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC適量,加水溶解,制成4 mmol/L 溶液,即得,在4 ℃下保存,臨用前用水稀釋到所需濃度。

2.4.3 凝血酶溶液制備 臨用前取10 IU/mL 人凝血酶原液適量,加水稀釋至所需濃度,即得,置于冰上待用。

2.4.4 待測(cè)溶液制備 取阿加曲班(陽(yáng)性對(duì)照)、順式曲札茋苷、反式曲札茋苷適量,DMSO 分別制成50 μmol/L、30 mmol/L、3 mmol/L 母液,臨用前用DMSO 稀釋至所需濃度,即得(以DMSO 為空白對(duì)照組)。

2.4.5 測(cè)定方法 采用熒光法測(cè)定。反應(yīng)體系為樣品溶液及陽(yáng)性、空白對(duì)照溶液各1 μL,酶溶液5 μL (1 IU/mL),緩沖液24 μL,水50 μL,加到96 孔板中,再加入底物溶液20 μL (200 μmol/L),立即置于酶標(biāo)儀上測(cè)定。設(shè)置樣品孔(樣品+酶)、標(biāo)準(zhǔn)孔(DMSO+酶)、空白孔(DMSO+水),激發(fā)光390/40 nm,發(fā)射光460/40 nm,測(cè)定時(shí)間間隔51 s,頂部檢測(cè),增益70,在25 ℃下反應(yīng)10 min,每個(gè)濃度設(shè)置2 個(gè)副孔,測(cè)定凝血酶抑制率,取平均值,公式為抑制率=[(△V標(biāo)準(zhǔn)孔-△V樣品孔)/ (△V標(biāo)準(zhǔn)孔-△V空白孔) ]×100%,其中△V 為平均反應(yīng)速度,通過(guò)GraphPad Prism 6 軟件對(duì)樣品反應(yīng)濃度對(duì)數(shù)與抑制率作圖,計(jì)算IC50。結(jié)果,阿加曲班IC50為29.63 nmol/L,表明造模成功,順式曲札茋苷、反式曲札茋苷IC50分別為48.42、3.40 μmol/L。

3 討論

文獻(xiàn)[16]對(duì)順式曲札茋苷的抗氧化活性進(jìn)行了模擬預(yù)測(cè),但該研究是基于理論推斷,并未獲得具體化學(xué)實(shí)體。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)光化學(xué)反應(yīng)首次將反式曲札茋苷轉(zhuǎn)化為順式異構(gòu)體,經(jīng)HPLC 分離后在低溫條件下回收溶劑,并通過(guò)高分辨質(zhì)譜、核磁共振、紫外光譜等技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,可為進(jìn)一步考察相關(guān)分析方法和生物活性奠定基礎(chǔ)。

前期對(duì)光化學(xué)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了考察,比較了254、365 nm 紫外光源及日光(約100 000 lx),發(fā)現(xiàn)365 nm紫外光源及日光的轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)高于254 nm 紫外光,為確保反應(yīng)可控性,最終采用365 nm 紫外光源；比較了15 min～10 h 的照射效果,發(fā)現(xiàn)15 min 內(nèi)即有順式曲札茋苷產(chǎn)生,隨著照射時(shí)間延長(zhǎng)其得率增加,但過(guò)長(zhǎng)(＞8 h) 時(shí)溶劑顏色加深,表明有其他微量成分產(chǎn)生,增加后續(xù)色譜分離難度,最終確定轉(zhuǎn)化時(shí)間為4 h；比較了甲醇、甲醇-水、乙醇、乙醇-水、丙酮等多種溶劑,發(fā)現(xiàn)甲醇、甲醇-水、乙醇、乙醇-水的提取效率高于丙酮,為方便溶劑回收,最終選擇甲醇。

通過(guò)HPLC 法對(duì)光化學(xué)反應(yīng)后的混合物進(jìn)行分離,考慮到未來(lái)工藝,流動(dòng)相采用廉價(jià)、低毒的95% 乙醇-水體系；為保證連續(xù)進(jìn)針以縮短分析時(shí)間,采用了等度洗脫；在順式曲札茋苷的制備過(guò)程中溫度控制非常關(guān)鍵,故將洗脫液用氮?dú)獯祾吆笤诤诎淡h(huán)境中冷凍干燥,以避免洗脫液中的該成分再次異構(gòu)化。另外,順式曲札茋苷在室溫下穩(wěn)定性較差,雖然最初獲得該成分時(shí)純度可高于95%,但24 h內(nèi)會(huì)降低至85% 以下,因條件所限,目前無(wú)法獲得其準(zhǔn)確可靠的熔點(diǎn)、紅外光譜、旋光等數(shù)據(jù),故建議在條件允許的情況下其貯存和使用應(yīng)盡量處于低溫、避光環(huán)境。

由于順式曲札茋苷熱穩(wěn)定性較差,故現(xiàn)階段該成分成藥性不理想,但常作為雜質(zhì)出現(xiàn)于反式曲札茋苷中。本實(shí)驗(yàn)初步摸索了順式曲札茋苷雜質(zhì)的檢測(cè)方法,該方法在拉薩大黃指紋圖譜[9]的基礎(chǔ)上對(duì)洗脫梯度進(jìn)行了調(diào)整,發(fā)現(xiàn)各色譜峰峰形、分離度良好,保留時(shí)間適中,能滿足分析要求,并首次證實(shí)經(jīng)強(qiáng)烈日光照射后反式曲札茋苷中含有順式異構(gòu)體,而且可通過(guò)加熱工藝使后者質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低至1%以下。由此提示,在注射用曲札茋苷的生產(chǎn)、貯存過(guò)程中應(yīng)注意避光,而且加熱工藝可降低雜質(zhì)含有量,與成品質(zhì)量有較大關(guān)聯(lián),故應(yīng)進(jìn)一步重點(diǎn)考察并確定參數(shù)范圍。

凝血酶是機(jī)體凝血系統(tǒng)中的重要組成因子,是觸發(fā)凝血反應(yīng)的效應(yīng)器,抗凝血酶活性與注射用曲札茋苷防治心腦血管疾病,特別是缺血性腦卒中的藥效密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),順式、反式曲札茋苷均具有抗凝血酶活性,但前者較后者大致降低了1 個(gè)數(shù)量級(jí)。有研究表明,二苯乙烯類化合物順?lè)串悩?gòu)體在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的藥動(dòng)學(xué)、組織分布等體內(nèi)過(guò)程有較大差異[17],其安全性也有明顯的不同,如何首烏中順式二苯乙烯苷對(duì)3D 培育的肝細(xì)胞模型的毒性大于反式異構(gòu)體,具有更大的肝損傷風(fēng)險(xiǎn)[18],表明順?lè)串悩?gòu)化不但會(huì)影響注射用曲札茋苷藥效,對(duì)其安全性也有潛在的重要影響。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)為注射用曲札茋苷質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步提高,特別是雜質(zhì)成分的控制提供了參考。今后,將圍繞順式曲札茋苷開(kāi)展進(jìn)一步研究,以期提高注射用曲札茋苷質(zhì)量,保障用藥安全。

致謝：感謝中國(guó)藥科大學(xué)生藥學(xué)研究室、上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所李娟博士對(duì)本文的審閱與指導(dǎo)。