張智敏 闞雨村江豪杰李亞梅 嚴建業(yè)林麗美*羅 堃*

(1.湖南中醫(yī)藥大學藥學院,湖南 長沙 410208;2.湖南中醫(yī)藥大學,湘產大宗藥材品質評價湖南省重點實驗室/湖南省中藥不良成分快速檢測及脫除工程技術研究中心,湖南 長沙 410208)

枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的未成熟果實,有效成分主要為生物堿、黃酮、揮發(fā)油,具有破氣消積、化痰散痞的功效[1],其中揮發(fā)油是枳殼理氣、行滯、鎮(zhèn)咳、祛痰、抑菌等作用的物質基礎[2]。以往文獻對枳殼揮發(fā)油的研究主要集中在化學成分[3],較少涉及抑菌活性[4-5]。

中藥成分復雜多樣,生物活性往往是多種成分作用于多靶點的整體結果。植物揮發(fā)油的抑菌活性也是由其成分組成決定的[6],而且不一定主要化合物[7],并通過協(xié)同或拮抗作用發(fā)揮效果[8-9]。

譜效關系是一種將化學特征鑒別與生物活性評價整合為一體的綜合性評價模式[10-12],對于成分復雜且有效成分不明確的中藥而言,是明確其藥效物質基礎、評價其質量的重要手段。其中,偏最小二乘回歸法集合了多元線性回歸、主成分分析和典型相關分析的優(yōu)點,可較好地揭示各色譜峰與藥效指標間的相關性[13-14]；雙變量相關分析[15]是一種研究兩個變量之間相互關系的統(tǒng)計學方法,以相關系數(shù)的大小及方向反映藥效指標與色譜峰關系的密切程度及正負關系。

因此,本實驗采用GC-MS 法分析枳殼揮發(fā)油化學成分,通過偏最小二乘回歸法、雙變量相關分析篩選并確定其抑菌化合物,從分子化學水平闡明其物質基礎,為尋求不良反應較小的天然中藥相關活性成分提供基礎。

1 材料

1.1 試劑與藥物 12 批枳殼經湖南中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實,具體信息見表1。氨芐西林[批號A100339-0005,生工生物工程(上海) 股份有限公司]；硫酸慶大霉素碳酸鉍(山西云鵬制藥有限公司)。乙酸乙酯、DMSO (二甲基亞砜)、無水硫酸鈉、氯化鈉均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

表1 樣品信息

1.2 菌株 金黃色葡萄球菌ATCC26003、大腸桿菌ATCC44138、沙門氏菌ATCC50115、表皮葡萄球菌(廣東省微生物菌種保藏中心)。

1.3 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號140720,杭州濱河生物試劑有限公司)；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號130730,杭州天和微生物試劑有限公司)。

1.4 儀器 GC-MS-QP2010 型色譜儀(日本Shimadzu 公司)；JK-G-522B3 型高速萬能粉碎機(上海精密科學儀器有限公司)；DZTW 型調溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；揮發(fā)油提取裝置(成都蜀?？萍加邢薰?；SW-CJ-2FD 型凈化工作臺(南京迅達空氣技術有限公司)；LDZM-60KCS 型高壓蒸汽滅菌鍋(上海永安醫(yī)療器械廠)；DH-400AB 型電熱恒溫培養(yǎng)箱(成都致力儀器有限公司)；ZHWY-200D 型恒溫振蕩器(上海智仁分析儀器制造有限公司)；DEN-1 型麥氏比濁儀(英國格蘭特儀器公司)。

2 方法與結果

2.1 炮制品制備 參照2015 年版《中國藥典》 進行。

2.2 揮發(fā)油提取 將生品和炮制品粉碎后過40 目篩,各取1 kg 粉末,置于10 000 mL 圓底燒瓶中,加入蒸餾水浸泡過夜,安裝揮發(fā)油提取裝置,參考2015 年版《中國藥典》 四部通則2204 揮發(fā)油測定法提取枳殼揮發(fā)油,經無水Na2SO4干燥后封裝備用。

2.3 抑菌活性檢測

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取氨芐西林粉末500 mg,無菌水定容至5 mL,得100 mg/mL 貯備液,精密吸取200 μL,無菌水稀釋至100 mL,即得200 μg/mL 相應陽性對照品溶液；精密稱取硫酸慶大霉素碳酸鉍0.3 g (每0.6 g 含40 mg 慶大霉素),無菌水稀釋至100 mL,即得200 μg/mL相應陽性對照品溶液。

2.3.2 菌懸液制備 將實驗用菌種接種于營養(yǎng)瓊脂平板上,37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h 后,挑選特征菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃搖床培養(yǎng)12 h 后采用麥氏比濁法,無菌生理鹽水將其稀釋至0.5 麥氏比濁單位,即1.5×108CFU/mL。

2.3.3 抑菌圈測定 采用濾紙片法[16]。取揮發(fā)油1 mL,0.22 μm 微孔濾膜過濾。將藥敏空白濾紙片置于潔凈干燥的培養(yǎng)皿中,干熱滅菌后加到揮發(fā)油中浸泡過夜,臨用前用無菌鑷子將紙片置管口干燥0.5 h。取20 mL 熔化后的營養(yǎng)瓊脂倒入9 cm 平板,待其凝固后吸取200 μL 菌液,均勻涂布于凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上,在每個含菌平皿呈正三角放入3 張含上述同種藥液的濾紙片,以氨芐西林為革蘭氏陽性菌的陽性對照,慶大霉素為革蘭氏陰性菌的陽性對照,無菌水為陰性對照,37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h 后取出,游標卡尺測量抑菌圈直徑,計算抑菌系數(shù)[17](樣品的抑菌圈直徑/陽性對照的抑菌圈直徑),結果見表2。

由此可知,生品、炮制品均對革蘭氏陽性菌的抑制效果更強,這是因為揮發(fā)油是通過破壞細菌的細胞膜而發(fā)揮這樣[18],而革蘭氏陽性菌、陰性菌細胞壁結構明顯不同,使前者對揮發(fā)油成分的敏感性通常比后者更明顯[7,19-20]；但沙門氏菌是個特例,由于它具有不同的細胞靶標,可通過多種形式特異性結合揮發(fā)油中不同成分,導致可能比某些革蘭氏陽性菌更加敏感[21-22]。

表2 揮發(fā)油抑菌圈測定結果（，n=3）

表2 揮發(fā)油抑菌圈測定結果（，n=3）

2.4 GC-MS 指紋圖譜建立

2.4.1 供試品溶液制備 精密吸取“2.2” 項下?lián)]發(fā)油200 μL,乙酸乙酯定容至5 mL,過0.22 μm 微孔濾膜,即得,冷藏備用。

2.4.2 GC-MS 分析 參考文獻[5]報道。

2.4.2.1 GC HP-5MS 石英毛細管柱(5% Phenyl Methyl Silox,0.25 μm×0.25 mm×30 m)；進樣口溫度280 ℃；載氣氦氣,體積流量1.0 mL/min；分流比10∶1；進樣量1 μL；程序升溫(柱溫60 ℃,保持3 min,2 ℃/min 升至80 ℃,5 ℃/min 升 至120 ℃,2 ℃/min 升至160 ℃,15 ℃/min 升至260 ℃,保持10 min)。

2.4.2.2 MS 電離方式EI；電子轟擊能70 eV；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；接口溫度260 ℃；質量范圍m/z 50～400。

2.4.3 方法學考察 對上述實驗條件進行方法學考察,發(fā)現(xiàn)儀器精密度、穩(wěn)定性、重復性良好,回收率RSD 均小于3.0%。

2.5 譜效關系分析

2.5.1 GC-MS 指紋圖譜建立 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A 版” 軟件,對16 批樣品的GC-MS指紋圖譜數(shù)據進行分析,以S4 為參照,經過多點校正、自動匹配后生成對照指紋圖譜(圖1),確定了12 個共有峰。經過質譜計算機數(shù)據系統(tǒng)檢索(NIST05.LIB、NIST05 s.LIB 質譜數(shù)據庫) 與CAS 號查詢,結合相關文獻和各項分析鑒定確定其成分,峰面積歸一化法計算各成分相對含有量,結果見表3。

圖1 揮發(fā)油對照指紋圖譜

由此可知,炮制前后共鑒定出12 種主要成分,分別占生品、炮制品揮發(fā)油總量的98.67%、97.55%；相對含有量較高的為D-檸檬烯、γ-萜品烯、芳樟醇、大根香葉烯D,在生品、炮制品揮發(fā)油中分別占 84.99%、6.57%、2.66%、1.39%,80.94%、7.44%、3.96%、1.95%。炮制前后揮發(fā)油總量及組成發(fā)生了變化,可能是由于麥麩與藥材共同加熱時可吸收部分揮發(fā)油,使其含有量降低,并改變了各組分間的比例[23]。

2.5.2 抑菌活性譜效分析 采用SPSS 17.0 軟件,以抑菌圈直徑為變量Y,色譜峰面積為變量X 進行相關分析,建立生品、炮制品共有峰峰面積與其藥效學的Pearson 相關系數(shù),見表4。再采用SIMCA 13.0 軟件進行偏最小二乘回歸法(PLSR) 分析,建立生品、炮制品對試驗菌的譜效關系模型,發(fā)現(xiàn)生品對沙門氏菌,炮制品對金黃色葡萄球菌的建模效果較好,標準化回歸系數(shù)圖和VIP 圖見圖2～3。

表3 共有峰成分鑒定及其相對含有量

表4 共有峰峰面積與抑菌圈直徑的Pearson 相關系數(shù)

在偏最小二乘法中,回歸系數(shù)絕對值反映色譜峰對抑菌圈直徑的貢獻程度,其數(shù)值越大,貢獻越大；回歸系數(shù)的符號反映與抑菌圈直徑的相關性,由于抑菌圈直徑與藥效呈正相關,故回歸系數(shù)為正的色譜峰是對揮發(fā)油抑菌活性有貢獻者。變量重要性值(VIP) 可評價自變量對因變量解釋的重要程度[24],當VIP ＞1 時,說明自變量是重要的。

結合雙變量相關分析結果可知,生品揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的抑制作用主要是由6、7 號色譜峰所代表的γ-萜品烯、4-蒈烯含有量決定,對表皮葡萄球菌的抑制作用主要是由2、6、11、7 號色譜峰所代表的β-蒎烯、γ-萜品烯、大根香葉烯D、4-蒈烯含有量決定,對大腸桿菌的抑制作用主要是由12、4 號色譜峰所代表的棕櫚酸甲酯、D-檸檬烯含有量決定,對沙門氏菌的抑制作用主要是由6、7 號色譜峰所代表的γ-萜品烯、4-蒈烯含有量決定；炮制品揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的抑制作用主要是由5、8 號色譜峰所代表的β-羅勒烯、芳樟醇含有量決定,對表皮葡萄球菌的抑制作用主要是由7 號色譜峰所代表的4-蒈烯含有量決定,對大腸桿菌的抑制作用主要是由4、1 號色譜峰所代表的D-檸檬烯、α-蒎烯含有量決定,對沙門氏菌的抑制作用主要是由2、9 號色譜峰所代表的β-蒎烯、α-萜品醇含有量決定。

3 討論

圖2 生品PLSR 標準化回歸系數(shù)和VIP 值

圖3 炮制品PLSR 標準化回歸系數(shù)和VIP 值

文獻報道,α-萜品醇、γ-萜品烯是揮發(fā)油中的強力抑菌成分[25],其中前者可抑制大腸桿菌、表皮葡萄球菌、白色念珠球菌等微生物的生長[7]；4-蒈烯被證實對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、白色念珠菌均有抑制活性[26]；芳樟醇具有廣譜抗細菌、真菌活性[27]；α-蒎烯、2-β-蒎烯、檸檬烯也有較強的抗細菌活性[28],這些成分通過破壞細菌或真菌細胞膜的完整性,從而對上述微生物發(fā)揮毒性作用[29]。Guo 等[30]分析國內栽培的幾種主要柑橘類品種中揮發(fā)油抑菌活性的物質基礎,發(fā)現(xiàn)β-蒎烯、芳樟醇對多種微生物具有顯著作用,α-蒎烯對乙型副傷寒沙門氏菌有一定效果。一些研究證明,檸檬烯具有殺菌、抗氧化等活性[31],但該成分容易氧化,而且難溶于水,導致其活性降低,故在高劑量下可能不會產生高抗菌活性,但如果將其與乳化劑或者其他天然抑菌成分組合時,則可在低劑量下即有顯著抑菌活性[32]。Haber 等[33]指出,揮發(fā)油主要成分大根香葉烯D 對蠟樣芽孢菌、金黃色葡萄球菌[34]、大腸桿菌、銅綠假單胞菌均有抑制作用,而羅勒烯可抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌,尤其是表皮葡萄球菌的生長[35]。另外,棕櫚酸甲酯也被證實具有抑菌活性[36]。以上發(fā)現(xiàn)均對本實驗起到了重要的支撐作用。

本實驗先通過GC-MS 法獲得枳殼揮發(fā)油指紋圖譜,濾紙片法得到其對4 種細菌的抑菌效果,然后采用PLSR、雙變量相關分析揭示了其譜效關系,發(fā)現(xiàn)對枳殼揮發(fā)油抑菌活性貢獻較大的成分主要為芳樟醇、α-萜品醇、D-檸檬烯、α-蒎烯、β-蒎烯、γ-萜品烯、4-蒈烯、大根香葉烯D、β-羅勒烯和棕櫚酸甲酯,并通過協(xié)同作用發(fā)揮效果。今后,將進一步分離枳殼揮發(fā)油藥效成分,分析其單體及多種成分通過協(xié)同/敵對作用在體外的抑菌活性,以及共有峰之外的色譜峰是否與其抑菌活性相關。

綜上所述,本實驗初步探討了枳殼揮發(fā)油發(fā)揮抑菌作用的主要有效成分,為解決細菌對抗生素的耐藥性,尋求不良反應較小的天然中藥香港活性成分提供依據,同時也為中藥譜效關系分析提供參考。