莫子晴 蔡 皓 *段 煜裴 科劉 靜張雅婷鈕敏潔

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心,江蘇 南京 210023;3.山西中醫(yī)藥大學(xué)制藥與食品工程學(xué)院,山西 太原 030024)

四逆散最早記載于張仲景所著《傷寒論》,由柴胡、白芍、枳實、炙甘草四味藥組成,具有疏肝解郁、和解表里之功效,為調(diào)節(jié)情志作用的經(jīng)典名方,也是中醫(yī)臨床治療抑郁的基礎(chǔ)方。醋是中藥炮制的一種重要輔料,具有引藥入經(jīng)、破血快、散瘀消腫的作用,被廣泛應(yīng)用于疏肝解郁、散瘀止痛藥物的炮制?！侗静菝审堋?有“用醋注肝經(jīng),且資住痛” 的記載。柴胡與白芍醋炙后,均能增強(qiáng)其疏肝解郁的作用[1-2]。作為君藥和臣藥,兩者炮制后也顯著提高了復(fù)方抗抑郁作用的效果[1]。然而,炮制后對復(fù)方產(chǎn)生功效及成分的具體影響目前仍然缺乏全面的數(shù)據(jù)證明。

為了揭示炮制對復(fù)方增效的科學(xué)內(nèi)涵,實驗室前期采用UHPLC-Q-TOF/MS 技術(shù)對柴胡和白芍醋炙前后組方的四逆散化學(xué)成分進(jìn)行比較,并結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析手段篩選出12 種成分為柴胡和白芍醋炙后組方四逆散增效的潛在物質(zhì)基礎(chǔ),包括柴胡皂苷B2等重要成分。柴胡皂苷是柴胡發(fā)揮抗抑郁作用的主要成分[3-4],而柴胡皂苷D 為藥理活性最高的單體之一[5]。芍藥苷可以改善利血平致抑郁模型小鼠腦組織5-HT 和NE 的含有量[6],且對皮質(zhì)酮和谷氨酸誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞具有保護(hù)作用[7]。甘草苷是炙甘草的重要活性成分,具有抗氧化、抗癌、抗抑郁等作用[8-10]。另有研究表明,橙皮素具有抗氧化、抗炎、保護(hù)心血管及抗腫瘤的藥效作用,是枳實的主要有效成分[11-13]。本研究采用雙波長HPLC 法探究柴胡和白芍醋炙前后組方對經(jīng)方四逆散中5 種成分含有量的影響,以期從物質(zhì)基礎(chǔ)的角度闡釋中藥炮制及配伍組方的科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料

1.1 儀器 E2695 高效液相色譜儀、Empower 色譜工作站、2998 紫外檢測器(美國Waters 公司)；KQ-500E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BSA224S-CW 天平(萬分之一,德國Sartorius 公司)；Quintix35-1CN 天平(十萬分之一,德國Sartorius 公司)。

1.2 試劑與藥物 柴胡皂苷D(批號C026181218)、柴胡皂苷B2(批號C051181206)、芍藥苷(批號S010180416)、甘草苷(批號G009181216)、橙皮素(批號C017181129) 對照品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司(純度均大于98%)。柴胡(批號20180601)、白芍(批號20180611)、枳實(批號20190129)、炙甘草(批號20180713) 飲片均購自銅陵禾田中藥飲片有限公司,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室劉訓(xùn)紅教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱(4.4 mm ×250 mm,5 μm)；流動相乙腈(A) -水(B),梯度洗脫(0～10 min,15% A；10～25 min,15%～22%A；25～35 min,22%～40% A；35～50 min,40%～45.1% A；50～70 min,45.1%～51.2% A；70～97 min,51.2%～95%A；97～100 min,5%A)；體積流量1 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長210 nm(柴胡皂苷D),240 nm (柴胡皂苷B2、芍藥苷、甘草苷、橙皮素)；進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見圖1。

2.2 混合對照品溶液制備 精密稱取柴胡皂苷D、柴胡皂苷B2、芍藥苷、甘草苷、橙皮素對照品適量,置同一5 mL 量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,配制成質(zhì)量濃度分別為1.334 mg/mL(柴胡皂苷D)、0.828 mg/mL (柴胡皂苷B2)、1.088 mg/mL (芍藥苷)、1.206 mg/mL (甘草苷)、1.124 mg/mL (橙皮素) 的溶液,即得,置4 ℃冰箱保存。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取柴胡、白芍、枳實、炙甘草各0.2 g,加入20 mL 70%甲醇,稱定質(zhì)量,超聲(1 200 W,40 kHz) 處理45 min,靜置,70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量,搖勻,濾過,濾液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得四逆散供試品溶液[14]；精密稱取醋柴胡、醋白芍、枳實、炙甘草各0.2 g,同法制得醋炙品組方四逆散供試品溶液。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 專屬性試驗 取各樣品,在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣,發(fā)現(xiàn)芍藥苷、甘草苷、橙皮素、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷D 的保留時間分別為16.85、20.03、39.83、45.03、58.38 min,其他成分對測定無干擾,見圖1。

2.5 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批飲片,按“2.3” 項下方法制備供試品溶液各6 份,在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣,測得四逆散中柴胡皂苷D、芍藥苷、甘草苷、橙皮素含有量RSD 分別為2.75%、2.38%、1.79%、2.93%,醋炙品組方四逆散(含醋柴胡及醋白芍) 中分別為2.74%、2.58%、1.13%、1.54%、2.16%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 精密度試驗 分別精密吸取柴胡皂苷D、柴胡皂苷B2、芍藥苷、甘草苷、橙皮素的低、中、高質(zhì)量濃度對照品溶液,在“2.1” 項色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣3 次,記錄峰面積,測得柴胡皂苷D RSD分別為2.99%、2.02%、1.94%,柴胡皂苷B2RSD分別為1.64%、1.55%、2.04%,芍藥苷RSD 分別為1.13%、0.22%、0.43%,甘草苷RSD 分別為2.04%、0.36%、0.36%,橙皮素 RSD 分別為2.75%、0.52%、0.31%,表明儀器精密度良好。

2.7 線性關(guān)系考察 精密吸取各對照品母液適量,甲醇稀釋成6 個質(zhì)量濃度,進(jìn)樣量20 μL。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸,結(jié)果見表1,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8 加樣回收率試驗 取已測含有量的同一批飲片組方四逆散 (含0.05 g 柴胡、0.05 g 白芍、0.05 g 炙甘草、0.05 g 枳實) 及同一批飲片醋炙品組方四逆散(含0.05 g 醋柴胡、0.05 g 醋白芍、0.05 g 炙甘草、0.05 g 枳實) 各6 份,精密加入柴胡皂苷D、芍藥苷、甘草苷對照品溶液適量,按“2.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣,計算回收率。結(jié)果見表2。

取已測含有量的同一批飲片組方四逆散(含0.2 g 柴胡、0.2 g 白芍、0.2 g 炙甘草、0.2 g 枳實) 及同一批飲片醋炙品組方四逆散(含0.2 g 醋柴胡、0.2 g 醋白芍、0.2 g炙甘草、0.2 g 枳實)各6 份,精密加入柴胡皂苷B2、橙皮素對照品溶液適量,按“2.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣,計算回收率及RSD。結(jié)果見表3。

表2 四逆散中各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents in Sinisan （n=6）

2.9 穩(wěn)定性試驗 按“2.3” 項下方法制備供試品溶液,室溫下放置,于0、4、8、12、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣,測得四逆散供試品溶液中柴胡皂苷D、芍藥苷、甘草苷、橙皮素的峰面積RSD 分別為2.81%、2.41%、2.38%、1.63%,醋炙品組方四逆散供試品溶液中分別為2.80%、2.41%、1.14%、1.39%、1.00%,表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 樣品含有量測定 按“2.3” 項下方法制備6 批供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣,計算含有量,結(jié)果見表4。

3 討論

一般而言,在單味藥中,柴胡經(jīng)醋炙后,Ⅰ型皂苷(柴胡皂苷A、柴胡皂苷D) 的含有量會顯著下降,而Ⅱ型皂苷(柴胡皂苷B2) 的含有量會明顯上升[15-18]。但根據(jù)反復(fù)實驗驗證,在柴胡和白芍醋炙后組方的四逆散中,柴胡皂苷D 的含有量不僅沒有降低,反而呈現(xiàn)小幅度的升高。柴胡皂苷D 在單味藥以及在君藥和臣藥醋炙前后組方中所表現(xiàn)出的完全不同的變化,進(jìn)一步表明四逆散中復(fù)雜的物質(zhì)環(huán)境能改變同一種物質(zhì)的溶出和轉(zhuǎn)化。Zhou等[1]研究表明,柴胡皂苷B2是柴胡和白芍醋炙配伍組方四逆散發(fā)揮抗抑郁作用的潛在增效物質(zhì)之一。本實驗經(jīng)多次驗證發(fā)現(xiàn),在四逆散中,柴胡皂苷B2的響應(yīng)值極低,幾乎檢測不到。而在柴胡和白芍醋炙配伍組方的四逆散中,柴胡皂苷B2的含有量有了明顯的升高,表明該推斷是合理可信的。

本實驗結(jié)果表明,柴胡皂苷B2、柴胡皂苷D的改變是醋炙品組方四逆散增強(qiáng)療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。而橙皮素以及甘草苷含有量的改變,進(jìn)一步表明柴胡和白芍醋炙后與枳實和炙甘草一起組方四逆散,不僅影響自身活性成分的浸出,也對其他中藥有效成分的含有量有所影響,這可能是由于柴胡與白芍醋炙后組方的酸性環(huán)境改變了物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和溶出的緣故。醋炙增效以及疏肝解郁的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

表3 醋炙品組方四逆散中各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents in Sinisan containing vinegar-processed Bupleuri Radix and Paeoniae Radix Alba （n=6）

表4 各成分含有量測定結(jié)果（mg/g，，n=6）Tab.4 Results of content determination of various constituents （mg/g，，n=6）

表4 各成分含有量測定結(jié)果（mg/g，，n=6）Tab.4 Results of content determination of various constituents （mg/g，，n=6）

注:與四逆散組比較,**P ＜0.01。