潘 宇 徐 菲 龔 輝吳芳芳陳 路曾楊麗李 娟蔣益蘭*李順祥*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙 410208;2.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園,廣西 南寧 530023;3.西南瀕危藥材資源開發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530023;4.湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心,湖南 長(zhǎng)沙 410208;5.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙 410006)

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率、致死率較高[1-2],急需挖掘復(fù)方中藥對(duì)肝癌的潛在治療價(jià)值。肝復(fù)樂是國(guó)家名中醫(yī)潘敏求教授經(jīng)多年臨床觀察潛心研究而發(fā)明的國(guó)家級(jí)抗癌三類新藥,治療中晚期肝癌的療效顯著[3-6],但該方治療肝癌發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制與作用靶點(diǎn)的國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究較少。課題組的前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)試驗(yàn)初步證實(shí)[7],磷脂酰肌醇 (phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha,PIK3CA)、半胱氨酸蛋白酶8 (caspase-8,CASP8) 是肝復(fù)樂治療肝癌的病理網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn),并且能影響PI3K-Akt/mTOR/JAkt-STAT/Wnt 等信號(hào)傳導(dǎo)通路,前人研究[8-9]發(fā)現(xiàn)這4 條關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)通路與肝癌的凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲浸潤(rùn)等病理機(jī)制密切相關(guān)。本文觀察肝復(fù)樂對(duì)人肝癌HepG-2 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲以及PIK3CA、CASP8 蛋白表達(dá)的影響,并與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證對(duì)比研究。

1 材料

1.1 儀器 RE-5205 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州鞏義予華儀器有限責(zé)任公司)；BSA124S-CW 電子天平(上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司)；BP211D 型萬分之一天平(德國(guó)Sartorius 公司)；SK3300H 型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；H1850離心機(jī)(上海趙迪儀器有限公司)；680 型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad 試劑公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO 公司)；754N 型紫外可見光分光光度計(jì)(上海天翔光學(xué)儀器有限公司)；LX71 倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；PowerPac 系列電泳儀(美國(guó)Corning costar 公司)。

1.2 藥物 肝復(fù)樂原生藥材內(nèi)的所有小分子化合物搜集來源于中草藥在線數(shù)據(jù)庫(kù)(TCM-ID、TCM Database@taiwan)。肝復(fù)樂21 味中藥材飲片[清熱解毒組(茵陳、敗醬草、半枝蓮、重樓)、健脾理氣組 (黨參、炒白術(shù)、黃芪、茯苓、薏苡仁、制香附、陳皮、柴胡、沉香、川木通)、活血化瘀組(醋鱉甲、土鱉蟲、桃仁、蘇木、生牡蠣、郁金、大黃) ]均由湖南國(guó)華制藥廠提供,經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉塔斯教授鑒定為正品,均符合2020 年版《中國(guó)藥典》 一部各藥材項(xiàng)下要求；鹽酸阿霉素 (浙江海正藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)86904641000828,規(guī)格100 mg)；肝復(fù)樂清熱解毒組、活血化瘀組、健脾理氣組、肝復(fù)樂全方組4 個(gè)醇溶部位；用磷酸緩沖鹽溶液(PBS) 溶解,保存于-20 ℃?zhèn)溆?使用前用無血清培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.3 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞株HepG-2 (中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院,批號(hào)XY-H0203),采用含10% Gibco胎牛血清(FBS) (上海栩冉生物科技有限公司,批號(hào)172000-023) 改良,RPMI-1640 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 試劑 PIK3CA 一抗(美國(guó)CST 公司,批號(hào)KL412265)；山羊抗兔IgG 二抗(Goat Anti-Rabbit IgG/HRP Antibody) (美國(guó)KPL 公司,批號(hào)SC-2301)；CCK-8 檢測(cè)試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司,批號(hào)250120512)；Transwell 試劑盒(美國(guó)BD Bioscience 公司,批號(hào)B190125)；蛋白質(zhì)定量試劑盒 (美國(guó) Invitrogen 公司,批號(hào)L181230)；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Pierce 公司,批號(hào)P170450)；96 細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Corning costar 公司,批號(hào)C160353)。

1.5 數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件 CambrigeSoft ChemOffice 2012(http://www.cambridgesoft.com/),Discovery Studio 2.55 (http://accelrys.com/),Cytoscape 3.7 (http://www.cytoscape.org/)。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建多成分-多靶點(diǎn)-多途徑-多疾病的相互作用模型 首先,從TCM-ID (http://www.megabionet.org/tcmid/)、TCM Database@taiwan (http://tcm.cmu.edu.tw/) 中草藥數(shù)據(jù)庫(kù)歸納整理974 個(gè)小分子化合物,并從ChemSpider(http://www.chemspider.com) 下載小分子2D&3D 的MOL 分子結(jié)構(gòu)。然后,從OMIM (http://www.omim.org/) 獲取8 個(gè)原發(fā)性肝癌靶標(biāo)(AXIN1[10]、CASP8[11]、CTNNB1[12]、TP53[13]、PDGFRL[14]、APC[15]、PIK3CA[16]和MET[17],靶標(biāo)蛋白信息見表1),靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系利用String (http://string-db.org/) 在線分析；運(yùn)用Discovery Studio 2.55 軟件中口服生物利用度(OB)、類藥性(DL) 作為篩選條件,設(shè)置OB≥30%、DL≥0.01,為了進(jìn)一步篩選潛在活性較高的小分子化合物,繼續(xù)預(yù)測(cè)上述篩選后的726個(gè)小分子化合物的代謝性質(zhì)(ADME,吸收、分布、代謝、排泄),設(shè)置生物篩選指標(biāo)(人體腸道吸收,6.1 ＜ALop ＜ 9.6、25 ℃；水中溶解度,-4.0＜log (Sw) ＜-2.0；穿透血腦屏障,-0.52 ＜BBB＜0.0),逐步篩選出198 個(gè)具有潛在抗肝癌活性的小分子,對(duì)初步篩選后的小分子化合物與上述的8 個(gè)原發(fā)性肝癌靶標(biāo)進(jìn)行分子對(duì)接運(yùn)算,在Discovery Studio 2.55 利用“Ligand Docking” (配體快速對(duì)接) 協(xié)議對(duì)這些優(yōu)化后的小分子化合物與靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接,運(yùn)用 binding energy、libdockscore、ligscore-1、ligscore-2、PLP-1和ligscore PLP-2 等多個(gè)打分函數(shù)進(jìn)行一致性打分,選取親和力最好的配體,篩選出69 個(gè)可能具有潛在活性最強(qiáng)的小分子化合物。分別從KEGG (http://www.genome.jp)、OMIM (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim) 獲取肝癌靶點(diǎn)相關(guān)的113 條生物作用途徑；利用Cytoscape3.7 (http://www.cytoscape.org/) 軟件建立“藥物-化合物-靶點(diǎn)-途徑-疾病” 的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)相互作用關(guān)系模型直觀圖。

表1 原發(fā)性肝癌靶標(biāo)蛋白Tab.1 Target protein of HCC

2.2 肝復(fù)樂藥材提取制備 肝復(fù)樂全方藥材以及3 個(gè)功效拆方組藥材的溶劑提取法采用專利技術(shù)嚴(yán)格制備[18-20],各藥材配伍量比關(guān)系嚴(yán)格按照其方法進(jìn)行等比例配伍組方,并根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際條件,改進(jìn)提取工藝。肝復(fù)樂上述藥材的含有量測(cè)定嚴(yán)格采用2010 年版《中國(guó)藥典》 方法進(jìn)行測(cè)定。肝復(fù)樂醇溶部位配制成1 g/mL 的母液,臨用前用培養(yǎng)液稀釋1 000 倍,使其終濃度小于0.1%。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG-2 采用含10% FBS 改良,RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),于5% CO2、飽和濕度的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)更換新的培養(yǎng)基,待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí),用0.25%的胰蛋白酶消化傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.4 分組 實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、阿霉素組(2 μg/mL),肝復(fù)樂清熱解毒組(醇溶部位)、肝復(fù)樂活血化瘀組(醇溶部位)、肝復(fù)樂健脾理氣組(醇溶部位)、肝復(fù)樂全方組(醇溶部位) 4 個(gè)藥物組,并分別設(shè)置低質(zhì)量濃度組(2.5 μg/mL)、中質(zhì)量濃度組(5 μg/mL)、高質(zhì)量濃度組(10 μg/mL)。

2.5 CCK-8 法檢測(cè)HepG-2 細(xì)胞的增殖影響 取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG-2 細(xì)胞,接種于96 孔板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將HepG-2 細(xì)胞按“2.4” 項(xiàng)下分組,加入0.1% 二甲基亞砜培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)24、48 h,往各孔細(xì)胞中緩慢滴入10 μL CCK-8 溶液,使用細(xì)胞酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(OD),計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率=(1-OD給藥組/OD空白對(duì)照組) ×100%。

2.6 Transwell 法檢測(cè)HepG-2 細(xì)胞的遷移能力HepG-2 細(xì)胞按“2.4” 項(xiàng)下分組,孵育24 h,常規(guī)消化,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105/mL；Transwell 小室中分別接種細(xì)胞200 μL,然后下室加入500 μL 10% FBS 的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基,孵育24 h；使用倒置熒光顯微鏡,觀察附著于小室底膜下表面的細(xì)胞形態(tài)；在450 nm 波長(zhǎng)處,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD,并間接計(jì)算遷移的細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞遷移率=(空白對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)-給藥組遷移細(xì)胞數(shù))/空白對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)) ×100%。

2.7 Transwell 法檢測(cè)HepG-2 細(xì)胞的侵襲能力制備Transwell 小室,細(xì)胞分組同“2.4” 項(xiàng)下,將各組細(xì)胞常規(guī)消化,室溫孵育,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL,Transwell 下室加入800 μL 含有15%FBS 的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基；孵育48 h 后用倒置顯微鏡(200 倍) 觀察穿過聚酯纖維膜的細(xì)胞,每組隨機(jī)選取3 個(gè)不同的視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲率=(1-給藥組穿膜細(xì)胞數(shù)目/空白對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)目) ×100%。

2.8 Western blot 法檢測(cè)CASP8、PIK3CA 蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)按“2.4” 項(xiàng)下分組,收集各組處理后48 h的HepG-2 細(xì)胞,裂解10 min,提取細(xì)胞中總蛋白。使用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,以半干法轉(zhuǎn)膜,將一抗用5%脫脂牛奶稀釋至適當(dāng)濃度,二抗用10×TBST 緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度,室溫下孵育1～2 h 后,洗滌3 次,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng),配置ECL 發(fā)光液,育膜5 min,顯影、曝光。采用QuantityOne 軟件分析,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH) 標(biāo)化,用凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以() 表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；不符合正態(tài)性,組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)；方差不齊時(shí),多組間均數(shù)比較采用Dunnett T3 檢驗(yàn)。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建多成分-多靶點(diǎn)-多途徑-多疾病的相互作用模型 網(wǎng)絡(luò)相互作用關(guān)系模型圖拓?fù)鋮?shù)分析表明(圖1),槲皮素(quercetin) (相鄰連接度=292.6,節(jié)點(diǎn)度=6)、β-谷甾醇(β-sitosterol) (相鄰連接度=363.8,節(jié)點(diǎn)度=6)、香草醛(vanilline) (相鄰連接度=111.2,節(jié)點(diǎn)度=4)、蒿素C (artemisin C) (相鄰連接度=243.5,節(jié)點(diǎn)度=4)、丁香酮 (eugenone)(相鄰連接度=290.8,節(jié)點(diǎn)度=5)、D-檸檬烯(d-limonene) (相鄰連接度=196.4,節(jié)點(diǎn)度=4)、芳樟醇(linalool)(相鄰連接度=143.1,節(jié)點(diǎn)度=3)、咖啡酸(caffeic acid) (相鄰連接度=138.2,節(jié)點(diǎn)度=4)和癸酸(capric acid) (相鄰連接度=123.4,節(jié)點(diǎn)度=3) 等活性成分比其他成分共享更多的靶點(diǎn),可能在體內(nèi)的多靶點(diǎn)生物網(wǎng)絡(luò)中調(diào)控更多的核心生物通路(癌癥通路、癌細(xì)胞凋亡通路、病毒致癌通路和內(nèi)部免疫調(diào)節(jié)通路等),Toll-like receptor/JAkt-STAT/PI3K-Akt/信號(hào)通路處于核心節(jié)點(diǎn)位置。肝癌靶 標(biāo) CASP8、PIK3CA、CTNNB1、AXIN1、TP53 是肝復(fù)樂21 味藥材共享連接的核心靶點(diǎn),活性分子若與某些疾病靶點(diǎn)相關(guān),則可能對(duì)靶點(diǎn)相關(guān)的疾病具有潛在治療作用[10-12]。C 型肝炎、B 型肝炎、結(jié)腸癌和乳腺癌處于疾病網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),揭示肝復(fù)樂極有可能對(duì)這些癌癥具有潛在的臨床治療作用。肝復(fù)樂理氣健脾組比清熱解毒組、活血化瘀組含有更多數(shù)量藥材與活性成分,并通過多靶點(diǎn)影響多條生物途徑發(fā)揮療效。茵陳(yinchen) (相鄰連接度=846.2,節(jié)點(diǎn)度=21)、柴胡(chaihu) (相鄰連接度=580.8,節(jié)點(diǎn)度=14)、黃芪(huangqi)(相鄰連接度=361.6,節(jié)點(diǎn)度=6)、沉香(chenxiang) (相鄰連接度=128.3,節(jié)點(diǎn)度=5)、黨參(dangshen) (相鄰連接度=246.3,節(jié)點(diǎn)度=10)、大黃(dahuang) (相鄰連接度=132.1,節(jié)點(diǎn)度=19)、白術(shù)(baishu) (相鄰連接度=133.6,節(jié)點(diǎn)度=5)這7 味藥材網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)比其它藥材網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)體現(xiàn)更好的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)(圖2),揭示這7 味藥材極有可能組成新的優(yōu)化精簡(jiǎn)組方,可對(duì)該方的活性成分進(jìn)行深入研究,提高肝復(fù)樂治療肝癌的臨床效果。

圖1 肝復(fù)樂功效拆方組-藥材-成分-靶點(diǎn)-靶點(diǎn)-生物途徑-疾病網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Fuctional group-herbal medicine-ingredients-targetstargets-biological pathways-disease network of GFL

圖2 肝復(fù)樂功效拆方組-藥材-成分-靶點(diǎn)-靶點(diǎn)Fig.2 Fuctional group-herbal medicine-ingredients-targets-targets network of GFL

3.2 人肝癌HepG-2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將2.5、5、10 μg/mL (低、中、高質(zhì)量濃度組) 的肝復(fù)樂4個(gè)醇溶部位分別作用于HepG-2 細(xì)胞48 h 后,空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生變化,細(xì)胞貼壁能力下降,可見核固縮、核碎裂和核溶解。當(dāng)藥物濃度逐漸升高,細(xì)胞形態(tài)變化愈加明顯,貼壁細(xì)胞數(shù)目占細(xì)胞總數(shù)的比例逐漸減小(圖3)。

3.3 肝復(fù)樂對(duì)HepG-2 細(xì)胞的增殖影響 如圖4 所示,藥物處理HepG-2 細(xì)胞24、48 h 后,5 μg/mL肝復(fù)樂全方組、肝復(fù)樂健脾理氣組細(xì)胞抑制率高于5 μg/mL 肝復(fù)樂清熱解毒組、肝復(fù)樂活血化瘀組(P＜0.05)；2.5 μg/mL 肝復(fù)樂全方組處理HepG-2細(xì)胞24 h 細(xì)胞增殖抑制率高于2.5 μg/mL 肝復(fù)樂功效拆方組(P＜0.05),但是處理48 h,肝復(fù)樂各濃度組細(xì)胞抑制增殖率并無明顯差異(P＞0.05)。給藥48 h 后,10 μg/mL 肝復(fù)樂健脾理氣組抑制HepG-2 細(xì)胞增殖抑制率高于10 μg/mL 其他藥物組(P＜0.05),由此可見,給藥48 h 后,肝復(fù)樂全方中、高質(zhì)量濃度組對(duì)HepG-2 細(xì)胞抑制比較明顯,因此作為后續(xù)細(xì)胞遷移、侵襲與蛋白表達(dá)影響實(shí)驗(yàn)作用濃度。

圖3 肝復(fù)樂醇溶部位作用HepG-2 細(xì)胞48 h 對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響（×200）Fig.3 Effects of alcohol soluble fraction of GFL on morphological changes of HepG-2 cells in 48 h （×200）

圖4 肝復(fù)樂醇溶部位對(duì)HepG-2 細(xì)胞增殖的影響（×200，n=3）Fig.4 Effects of alcohol soluble fraction of GFL on proliferation of HepG-2 cells （×200，n=3）

3.4 肝復(fù)樂對(duì)HepG-2 細(xì)胞的遷移影響 給藥48 h后,與空白對(duì)照組比較,肝復(fù)樂功效拆方組無細(xì)胞遷移抑制作用(P＞0.05),肝復(fù)樂全方組、阿霉素組抑制細(xì)胞遷移(P＜0.05)。與阿霉素組相比,5、10 μg/mL 肝復(fù)樂全方組干預(yù)的HepG 細(xì)胞視野中不同透膜細(xì)胞數(shù)目相對(duì)略多,細(xì)胞間隙略大,疊加生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)目略多,說明阿霉素組抑制肝癌細(xì)胞遷移能力略強(qiáng)于肝復(fù)樂全方組,肝復(fù)樂全方組細(xì)胞遷移率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；肝復(fù)樂3 個(gè)功效拆方組細(xì)胞遷移率降低(P＜0.05)。見表2、圖5。

3.5 肝復(fù)樂對(duì)HepG-2 細(xì)胞的侵襲影響 給藥處理HepG-2 細(xì)胞48 h 后,隨著藥物濃度的增加,視野中透膜的細(xì)胞數(shù)目逐漸減少,細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)閳A形或橢圓形,細(xì)胞間隙也逐漸增大。與空白對(duì)照組比較,肝復(fù)樂全方組、阿霉素組能抑制人肝癌HepG-2 細(xì)胞的侵襲(P＜0.05)。5 μg/mL 肝復(fù)樂3個(gè)功效拆方組細(xì)胞穿膜數(shù)目相對(duì)5 μg/mL 肝復(fù)樂全方組減少(P＜0.05),說明肝復(fù)樂全方中濃度組對(duì)細(xì)胞侵襲能力的抑制作用明顯強(qiáng)于肝復(fù)樂功效拆方中濃度組。見表3、圖6。

表2 肝復(fù)樂醇溶部位對(duì)HepG-2 細(xì)胞遷移能力的影響（，n=3）Tab.2 Effects of alcohol soluble fraction of GFL on migration of HepG-2 cells （，n=3）

表2 肝復(fù)樂醇溶部位對(duì)HepG-2 細(xì)胞遷移能力的影響（，n=3）Tab.2 Effects of alcohol soluble fraction of GFL on migration of HepG-2 cells （，n=3）

注:與空白對(duì)照組比較,▲P＜0.05；與阿霉素組比較,#P＜0.05。

表3 肝復(fù)樂醇溶部位對(duì)HepG-2 細(xì)胞侵襲能力的影響（，n=3）Tab.3 Effects of alcohol soluble fraction of GFL on invasion of HepG-2 cells （，n=3）

表3 肝復(fù)樂醇溶部位對(duì)HepG-2 細(xì)胞侵襲能力的影響（，n=3）Tab.3 Effects of alcohol soluble fraction of GFL on invasion of HepG-2 cells （，n=3）

注:與空白對(duì)照組比較,▲P ＜0.05；與全方中質(zhì)量濃度組比較,△P＜0.05；與阿霉素組比較,#P＜0.05。

圖5 肝復(fù)樂醇溶部位對(duì)HepG-2 細(xì)胞遷移的影響（×200）Fig.5 Effects of alcohol soluble fraction of GFL on migration of HepG-2 cells （×200）

圖6 肝復(fù)樂醇溶部位對(duì)HepG-2 細(xì)胞的侵襲影響（×200，n=3）Fig.6 Effects of alcohol soluble fraction of GFL on invasion of HepG-2 cells （×200，n=3）

3.6 肝復(fù)樂對(duì)HepG-2 細(xì)胞的CASP8、PIK3CA 蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較,肝復(fù)樂全方及功效拆方組作用于HepG-2 細(xì)胞48 h 后,CASP8、PIK3CA 蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)；與阿霉素組比較,10 μg/mL 肝復(fù)樂健脾組、全方組CASP8、PIK3CA 蛋白表達(dá)下調(diào)(P＜0.05),但在肝復(fù)樂清熱組、活血組蛋白表達(dá),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖7。

4 討論

圖7 肝復(fù)樂對(duì)HepG-2 細(xì)胞的CASP8、PIK3CA 蛋白表達(dá)的影響（n=3）Fig.7 Effects of Ganfule on expression of CASP8 and PIK3CA related proteins of HepG-2 cell （n=3）

前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明[7],肝復(fù)樂是通過多成分、多靶點(diǎn)、多途徑來調(diào)控疾病病理網(wǎng)絡(luò)重新恢復(fù)機(jī)體平衡。揮發(fā)油類,比如香草醛、蒿素C、丁香酚、D-檸檬烯、咖啡酸單體化合物可能是抗肝癌活性具有最明顯效果的活性組分,需要未來的藥理實(shí) 驗(yàn)進(jìn)一 步驗(yàn)證。CASP8、PIK3CA、CTNNB1、AXIN1、TP53 是肝復(fù)樂21 味藥材共享連接的肝癌核心靶標(biāo),這些靶標(biāo)可作為下一步的測(cè)試體外肝癌細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證靶點(diǎn)蛋白的表達(dá)水平。核心靶標(biāo)與PI3K-Akt/mTOR/JAkt-STAT/Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)通路密切相關(guān),肝復(fù)樂的抗肝癌作用機(jī)理很有可能是能通過CASP8、PIK3CA 核心靶標(biāo)調(diào)節(jié)這4 個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路。文獻(xiàn)報(bào)道[21-23]這4 個(gè)信號(hào)通路與常見惡性腫瘤增殖病理機(jī)理密切相關(guān),比如肝細(xì)胞癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌與乳腺癌。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示肝復(fù)樂可能對(duì)胰腺癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、人類T 淋巴細(xì)胞白血病、病毒I 型感染等疾病具有治療作用,這需要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

肝復(fù)樂全方組能明顯抑制HepG-2 細(xì)胞遷移能力和侵襲能力,幾乎等同于阿霉素的干預(yù)效果(P＞0.05)。肝復(fù)樂3 個(gè)功效拆方組與全方組相比,對(duì)HepG-2 細(xì)胞遷移能力及侵襲能力并無明顯抑制作用。分別用中質(zhì)量濃度組(5 μg/mL)、高質(zhì)量濃度組(10 μg/mL),在相同時(shí)間(48 h) 處理HepG-2 細(xì)胞,相互比較3 個(gè)功效拆方組抑制HepG-2 細(xì)胞的遷移與侵襲影響,結(jié)果并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),推測(cè)肝復(fù)樂3 個(gè)功效組可能對(duì)HepG-2 細(xì)胞并無明顯的遷移與侵襲影響。上述實(shí)驗(yàn)表明肝復(fù)樂健脾理氣組通過提高人體的免疫能力來發(fā)揮抗肝癌的功效,可能并不是通過干預(yù)癌細(xì)胞遷移、侵襲的作用途徑,也許是通過抑制癌細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡等其他機(jī)制發(fā)揮療效。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果具有一定的局限性,這需要開展后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。另外推測(cè),肝復(fù)樂功效拆方組的藥物濃度或者作用時(shí)間,可能并未達(dá)到具備干預(yù)影響效應(yīng)的臨界值,需要提高濃度或者延長(zhǎng)作用時(shí)間,此初步結(jié)論尚需進(jìn)一步的研究探討。

觀察肝復(fù)樂不同濃度的藥物組作用于PIK3CA、CASP8 蛋白的表達(dá)影響,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,與對(duì)照組比較,肝復(fù)樂全方組以及3 個(gè)功效拆方組均能明顯調(diào)控PIK3CA、CASP8 蛋白的表達(dá)(P＜0.05),并且調(diào)控水平隨濃度增加而增強(qiáng)。與阿霉素組相比,肝復(fù)樂全方組、健脾理氣組的調(diào)控水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但是,肝復(fù)樂清熱解毒組、活血化瘀組,均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。此結(jié)果揭示,肝復(fù)樂全方組可能通過對(duì)HepG-2 細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲相關(guān)的致癌關(guān)鍵因子PIK3CA、CASP8 靶點(diǎn)蛋白的影響,來調(diào)控PI3K/Akt/JAkt-STAT/Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)通路。并進(jìn)一步證實(shí)了肝復(fù)樂全方組的配伍效果以及臨床療效明顯優(yōu)于清熱解毒組、活血化瘀組與健脾理氣組,這一結(jié)論與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較吻合,進(jìn)一步加強(qiáng)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)論的可靠性與真實(shí)性,并與肝復(fù)樂的發(fā)明人潘敏求教授的實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持一致。

肝復(fù)樂全方組調(diào)控PIK3CA、CASP8 蛋白的表達(dá),比清熱解毒組、活血化瘀組、健脾理氣組等3個(gè)功效拆方組更具明顯差異。肝復(fù)樂健脾理氣組調(diào)控PIK3CA、CASP8 蛋白的表達(dá)比清熱解毒組、活血化瘀組更加明顯。結(jié)果揭示肝復(fù)樂可能是通過調(diào)控PIK3CA、CASP8 蛋白表達(dá),間接干預(yù)PI3KAkt/mTOR/JAkt-STAT/Wnt 等信號(hào)傳導(dǎo)通路。體外細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能完全代替人體肝癌發(fā)病機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)在HepG-2 細(xì)胞株上的細(xì)胞和蛋白的觀察情況,是否在人體肝癌中具有相同效應(yīng)仍不確定。另外PIK3CA、CASP8 靶點(diǎn)蛋白對(duì)HepG-2 細(xì)胞基因表達(dá)譜影響的作用機(jī)制尚不明確,需要今后進(jìn)一步深入研究。