劉心蕊，蒲靜，李雪，潘朋歌，張寧

（寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750004）

0 引言

近年來，在社會、環(huán)境及個(gè)人等多方面因素的綜合影響下，全球范圍內(nèi)不孕不育的發(fā)病率不斷提升，由此也引發(fā)了全球醫(yī)療的廣泛關(guān)注。目前對于不孕不育的治療，臨床上所應(yīng)用的輔助生殖技術(shù)雖然種類很多，但對于生殖細(xì)胞缺陷諸如卵巢早衰的患者始終無法達(dá)成很好的治療效果。早在2003年國外研究人員就成功的從胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)出了卵母樣細(xì)胞，由此也對諸多的不孕患者帶來了全新的生機(jī)與希望。但需要強(qiáng)調(diào)的是胚胎干細(xì)胞高表達(dá)端粒酶具有著較為突出的致瘤性。此外，還有研究證實(shí)，羊膜上皮細(xì)胞同樣具有著突出的多樣性特點(diǎn)，同時(shí)能夠表達(dá)潛能干細(xì)胞特定的轉(zhuǎn)錄因子，但對于干細(xì)胞中的端粒酶基因并不能表達(dá)，其來源又源自于廢棄胎盤，并無倫理學(xué)爭議[1-2]。而且，從大量的體外研究也均有力的證實(shí)了hAECs所具有的向3個(gè)胚層細(xì)胞分化的能力。對此，本次研究特使用人卵泡液為誘導(dǎo)劑，針對hAECs的作用從生態(tài)學(xué)和基因蛋白水平進(jìn)行了觀察，旨在為生殖細(xì)胞缺如女性不孕患者的治療提供可靠參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料。采用我院產(chǎn)科近1年行剖宮產(chǎn)分娩的健康產(chǎn)婦胎盤組織，經(jīng)血清學(xué)和病毒學(xué)檢測結(jié)構(gòu)呈陰性，并從經(jīng)輔助生殖技術(shù)體外受精助孕的婦女中提取卵泡。研究均經(jīng)患者知情且同意。此次研究中所應(yīng)用的主要試劑包括：DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清、人上皮生長因子、胰蛋白酶、PCR引物、PCR試劑盒、DAZL山羊多克隆抗體等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 hAECs分離培養(yǎng)及鑒定：針對羊膜與絨毛膜進(jìn)行鈍性分離，并將其放置于含有雙抗的培養(yǎng)液中進(jìn)行反復(fù)多次沖洗。沖洗完畢使用眼科剪將其剪成小塊，隨即加入37℃、0.05%的胰蛋白酶，震蕩消化處理10 min。隨后將上層清液吸除，再加入37℃、0.05%的胰蛋白酶震蕩消化30 min.結(jié)束后再使用10%血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行終止消化處理。隨即使用網(wǎng)篩過濾取200×g細(xì)胞懸液，并進(jìn)行4℃恒溫離心處理10 min，后以1×107密度于培養(yǎng)瓶中接種，并將其放置于5%、37℃的是否為無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)2～3 d。隨后進(jìn)行換液，待培養(yǎng)細(xì)胞增長至80%融合后傳代。使用顯微鏡針對原代細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)變化進(jìn)行觀察，并采用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行檢測證實(shí)，證明：原代hAECs能夠?qū)崿F(xiàn)上皮細(xì)胞特異性細(xì)胞角蛋白19和Oct-4基因的表達(dá)。

1.2.2 hAECs的誘導(dǎo)分化處理：選取已完成細(xì)胞融合80%的第一代hAECs，均分對照組與誘導(dǎo)組兩組并給予差異化處理，其中對照組EMMA培養(yǎng)基中含5%的胎牛血清、5000U 肝素鈉以及2 mmol/L的L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L的非必需氨基酸、0.1 mool/L的β-巰基乙醇，觀察組中在對照組添加的基礎(chǔ)上再添加5%的人工卵泡。兩組培養(yǎng)基每間隔3 d進(jìn)行1次更換。針對培養(yǎng)基用域E2檢測含量檢測的上清液進(jìn)行收集，并再顯微鏡下針對兩組細(xì)胞形態(tài)變化進(jìn)行觀測，在誘導(dǎo)兩周后（14 d）針對兩組細(xì)胞總RNA和蛋白進(jìn)行分別搜集。

1.2.3 RT-PCR檢測基因表達(dá)：對所搜集的兩組RNA，依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成，并在定量PCR儀上使用PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體反應(yīng)條件為：DAZL基因 95℃ 2 min，95℃ 10s，56℃ 10 s，72℃15s，總計(jì)39個(gè)循環(huán)。GDF9與SCP3和β-actin反應(yīng)條件為95℃ 2 min，95℃ 10s，56℃ 10s，72℃ 15s，同樣供39個(gè)循環(huán)。針對PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳處理，針對增產(chǎn)物的純度、GDF9、SCP3、DAZL基因表達(dá)進(jìn)行觀察。針對內(nèi)參基因β-actin與目標(biāo)基因的比值進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 蛋白表達(dá)檢測：待完成14d的誘導(dǎo)處理之后，使用含有coktail的蛋白裂解液RIPA分別對兩組細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)裂解處理，待經(jīng)超聲離心處理后對其蛋白上清進(jìn)行收集，并針對兩組的蛋白濃度使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測定，并使用凝膠成像掃描系統(tǒng)完成掃描。以DAZL與內(nèi)參β-actmin的光密度比值界定為DZAZL蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次，最終結(jié)果以（±s）表示，組間差異使用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05，說明組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hAECs形態(tài)學(xué)特征與鑒定結(jié)果分析。結(jié)果顯示，原代hAECs生長較快，經(jīng)2～3 d的培養(yǎng)后可達(dá)成80%～90%的高度融合。當(dāng)原代hAECs傳遞至第3代之后，細(xì)胞生長速度與貼壁率下降明顯，hAECs由于端粒酶的缺乏無法實(shí)現(xiàn)無限增殖，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)特使用1代hAECs代替。

2.2 培養(yǎng)上清液中E2水平變化觀察。經(jīng)化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)檢測顯示，在14d的誘導(dǎo)處理過程中，對照中并無E2生成，誘導(dǎo)組中存在E2生成，其基礎(chǔ)含量經(jīng)測定約為（1.76±0.08）×104PG/ML，至第4其含量降至（0.96±0.06）×104PG/ML，隨后呈現(xiàn)逐步增加趨勢，至誘導(dǎo)第10d達(dá)到最高值，為（2.55±0.07）×104PG/ML。

2.3 RT-PCR檢測生殖細(xì)胞特異性基因表達(dá)分析。在經(jīng)過14 d誘導(dǎo)處理后，含由5%人卵泡液的誘導(dǎo)組與對照組相比，生殖細(xì)胞特異性基因GDF9和DAZL的mRNA含量明顯較高，P＜0.05，而SCP3的mRN表達(dá)量則無明顯差異，P＞0.05。

2.4 Western blot檢測與DAZL蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，經(jīng)14 d誘導(dǎo)處理后誘導(dǎo)組DAZL基因表達(dá)水平為（0.704±0.031），而對照組為（0.172±0.03），P＜0.05。

3 討論

隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，胚胎干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的實(shí)現(xiàn)也使得通過干細(xì)胞一直來治療不孕不育成為了可能。人羊膜上皮細(xì)胞，源自于受精8d后的原腸胚形成之前的外胚層，也具有了原腸胚形成前期胚胎干細(xì)胞的可塑性。通過查閱近期研究也可發(fā)現(xiàn)，hAECs在不同的微環(huán)境調(diào)控與生長因子刺激下是可以分化為3個(gè)胚層不同類型細(xì)胞的，也能夠完成多潛能干細(xì)胞特定轉(zhuǎn)錄因子oTC-4和Nanog的表達(dá)，由此也說明hASCs具有了與ESCs類似的多向分化功能。此外，hASCs不能對干細(xì)胞的端粒酶基因進(jìn)行表達(dá)，因此也不具備無限增殖的功能和致瘤性。此外，國內(nèi)研究表示，人工羊膜上皮細(xì)胞具備抗炎因子分泌功能，因此也能夠有效的預(yù)防移植后炎癥反應(yīng)的發(fā)生[3-4]。

在此次研究實(shí)驗(yàn)中，使用人卵泡液為誘導(dǎo)劑，在經(jīng)歷為期14d的誘導(dǎo)之后，通過對細(xì)胞融合生長的觀察發(fā)現(xiàn)，其形態(tài)學(xué)改變與前人研究成果高度一致。結(jié)果顯示，DAZL基因在生殖細(xì)胞的發(fā)育早期就已經(jīng)開始表達(dá)，屬于減數(shù)分裂前期生殖細(xì)胞的標(biāo)志基。GDF9屬于卵母細(xì)胞分化后期的特異標(biāo)志，而SCP3則是對哺乳動(dòng)物減數(shù)分裂轉(zhuǎn)變檢測的高度特異性標(biāo)志。在實(shí)驗(yàn)中通過RT-PCR技術(shù)針對誘導(dǎo)組細(xì)胞進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)生殖細(xì)胞特異性基因（GDF9、DAZL）的mRNA表達(dá)水平相對較高，而SCP3的基因表達(dá)則于對照組無明顯差異，并通過使用Western blot方法對DAZL蛋白表達(dá)水平的檢測發(fā)現(xiàn)，對照組基因表達(dá)量相對較高。由此也有力的證實(shí)了：人卵泡液能夠?qū)崿F(xiàn)在體外誘導(dǎo)hAECs向雌性生殖細(xì)胞方向成功轉(zhuǎn)化，但該細(xì)胞并不具備減數(shù)分裂的能力。

總而言之，通過此次研究可以得出結(jié)論：人工卵泡能夠誘導(dǎo)hAECs向雌性生殖細(xì)胞方向轉(zhuǎn)分化，由此也為生殖細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化提供了一種全新的干細(xì)胞來院，為不孕不育患者的治療帶來了全新的生機(jī)和希望。但需要明確的是，在此次研究中卵細(xì)胞生成并未明確，而且所身生成的生殖細(xì)胞也不具備減數(shù)分裂的能力，因此無法得到成熟的卵細(xì)胞，這也是需要后期投入更多的時(shí)間和精力去深入探索研究的。