王麗麗，祝美華，薛 松，齊 寧，牛貴清，陳建英,

（1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101；2. 山東安華生物醫(yī)藥股份有限公司，山東 濱州 256600；3. 山東省皮膚與黏膜給藥工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101）

透明質(zhì)酸（hyalouronic acid，HA）是D-葡糖醛酸（GlcA）和N-乙酰氨基葡糖 （GlcNAc）雙糖單位通過(guò)交替的β-1, 3和β-1, 4糖苷鍵連接而成的大分子糖胺聚糖，大量存在于生物體內(nèi)的多種組織（例如皮下組織、眼球、關(guān)節(jié)）中，商品透明質(zhì)酸多為鈉鹽。它能攜帶自身500倍以上的水分，具有良好的吸濕性，是目前公認(rèn)的最佳天然保濕因子，被廣泛應(yīng)用于化妝品等領(lǐng)域[1-3]。HA為聚陰離子多糖，在使用于帶負(fù)電荷的毛發(fā)、皮膚的角質(zhì)表面時(shí)，由于電荷排斥作用，阻礙其在毛發(fā)、皮膚表面的吸附。

本研究采用化學(xué)方法將季銨陽(yáng)離子乳酸鹽基團(tuán)引入透明質(zhì)酸分子中，制備陽(yáng)離子化透明質(zhì)酸衍生物，并評(píng)價(jià)了其保濕、吸附性能，及對(duì)損傷毛發(fā)的修復(fù)效果和對(duì)頭發(fā)柔順度的改善，為其在化妝品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Unity Inova 400核磁共振波譜儀（美國(guó)Varian）；C-MAG HS10型加熱磁力攪拌器（艾卡廣州儀器設(shè)備有限公司）；ZKXFB-2型真空干燥箱（上海樹立儀器儀表有限公司）；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；Agilent 8454型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫公司）；AE200型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；JJ-1增力電動(dòng)攪拌器（江辦金壇醫(yī)療儀器廠）；320型pH計(jì)（瑞士Mettler Toledo公司）；Supra55電子掃描電鏡（德國(guó) Zeiss公司）；Unity Inova 400核磁共振波譜儀（美國(guó)瓦里安公司）；XJ801型頭發(fā)梳理儀（上海湘杰儀器儀表科技有限公司）。

1.2 材料

HA（山東安華生物醫(yī)藥股份有限公司，化妝品級(jí)）； 2, 3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨（GAT，河北百靈威超精細(xì)材料有限公司，純度95 %）；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 陽(yáng)離子化透明質(zhì)酸衍生物（HA-GAT-LA）的制備[4]

取HA 10 g和GAT 10 g，混合，加入1 %（g/ml）氫氧化鈉水醇（4:1）混合溶液100 ml，于40±2 ℃保溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，加入1 %乳酸鈉溶液400 ml，溶解并稀釋反應(yīng)產(chǎn)物，過(guò)濾，收集濾液，加入95 %乙醇500 ml洗滌沉淀2次，去除上清，過(guò)濾收集沉淀，再加入95 %乙醇洗滌沉淀2次，40 ℃減壓干燥6 h，得白色顆粒狀粉末。

按上述方法，反應(yīng)結(jié)束以10 %氯化鈉溶液代替10 %（g/ml）的乳酸-乳酸鈉溶液，制備未引入乳酸基團(tuán)的陽(yáng)離子化透明質(zhì)酸鈉（HA-GAT）。

2.2 HA-GAT-LA季銨陽(yáng)離子取代度和乳酸結(jié)合率的測(cè)定

以D2O為溶劑，采用Unity Inova 400核磁共振波譜儀對(duì)HA-GAT-LA進(jìn)行1H-NMR檢測(cè)，譜圖分析時(shí)化學(xué)位移以TMS峰位置為標(biāo)準(zhǔn)，以透明質(zhì)酸、季銨和乳酸基團(tuán)甲基氫的比例，計(jì)算季銨陽(yáng)離子取代度和乳酸結(jié)合率。

2.3 吸濕性和保濕性的測(cè)定

精密稱取HA、HA-GAT和HA-GAT-LA 各10 g，分別均勻平鋪于玻璃平皿中，厚度約2 mm，置92.5 %相對(duì)濕度（RH）環(huán)境48 h后，再分別置不同濕度環(huán)境（硅膠干燥器、43 %RH和81 %RH），于24，48 h取樣，測(cè)定樣品的干燥失重[5-6]，計(jì)算樣品的水分含量。

2.4 吸附量的測(cè)定

選取健康青少年未經(jīng)燙染的黑色頭發(fā)，用1 %月桂基硫酸三乙醇胺水溶液浸漬1 min，然后用水清洗，再用吸水紙吸去水分，置硅膠干燥器干燥24 h。加入漂白液（5 %過(guò)氧化氫水和 2.5 %氨水按1:1混合），于30 ℃浸漬20 min，反復(fù)清洗和漂白10次，制成損傷毛發(fā)[7]。

分別取HA、HA-GAT-LA和HA-GAT 0.1 g，置入100 ml量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，再稱取上述溶液4 g，置入50 ml量瓶，加水稀釋至刻度，獲得濃度約0.008 %的供試品溶液，取20 ml移至帶蓋試管中，置于 37 ℃水浴。精密稱量健康頭發(fā)和損傷頭發(fā)各2 g，置于供試品溶液中浸漬10 min。以咔唑顯色法[8]測(cè)定供試品溶液和浸漬毛發(fā)后供試品溶液糖醛酸含量，按下式計(jì)算毛發(fā)對(duì)HA、HA-GAT-LA和HA-GAT的吸附量（R）。

式中A0，A1分別為供試品溶液和浸漬毛發(fā)后供試品溶液經(jīng)咔唑法顯色后在530 nm處的吸收度值。

2.5 掃描電鏡觀察

將2.3項(xiàng)下經(jīng)HA、HA-GAT和HA-GAT-LA 3種供試液浸漬后的損傷毛發(fā)用吸水紙吸干水分，置平皿中于60±5 ℃烘干，和未經(jīng)浸漬的毛發(fā)一起黏貼于樣品托上，噴金，置掃描電鏡下觀察。

2.6 頭發(fā)梳理試驗(yàn)

取健康長(zhǎng)頭發(fā)一束，分別用普通市售洗發(fā)水（對(duì)照組）和加入0.5 %HA-GAT-LA的洗發(fā)水（試驗(yàn)組）揉洗1 min，大量清水沖洗至無(wú)泡沫，吸水紙吸干頭發(fā)表面水分，置頭發(fā)梳理儀測(cè)定濕梳摩擦阻力，用吹風(fēng)機(jī)將頭發(fā)吹干之后，測(cè)定干梳摩擦阻力。

3 結(jié)果

3.1 HA-GAT-LA的陽(yáng)離子取代度及乳酸結(jié)合率

HA-GAT收率＞80 %。1H NMR（400 MHz，D2O）δ：2.03（s，3H）；3.23（s，9H）。以透明質(zhì)酸和季銨基團(tuán)甲基氫的比例，計(jì)算HA-GAT的季銨陽(yáng)離子取代度為0.76。

HA-GAT-LA收率＞85 %。1H NMR（400 MHz，D2O）δ：1.32～1.33（d，3H）；2.03（s，3H）；3.23（s，9H）。以透明質(zhì)酸、季銨和乳酸基團(tuán)甲基氫的比例，計(jì)算HA-GAT-LA的季銨陽(yáng)離子取代度為0.76，乳酸結(jié)合率為85 %。

圖1 HA、HA-GAT和HA-GAT-LA的吸濕性

3.2 吸濕性和保濕性

結(jié)果見(jiàn)圖1。HA、HA-GAT和HA-GAT-LA在92.5 %RH高濕度環(huán)境放置48 h后，HA-GAT-LA水分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于HA和HA-GAT，說(shuō)明在高濕環(huán)境中HA-GAT-LA能迅速吸收大量水分；充分吸濕后的樣品再分別置于有硅膠干燥劑的干燥環(huán)境中、43 %RH和81 %RH的中等濕度環(huán)境中，HA-GATLA和HA-GAT的水分均高于HA，而HA-GAT-LA表現(xiàn)尤其突出，在RH降低的情況下仍能保持較高含水量。以上結(jié)果表明，HA-GAT-LA的吸濕和保濕性能明顯好于HA和HA-GAT。

3.3 吸附量

結(jié)果見(jiàn)圖2。HA、HA-GAT和HA-GAT-LA浸漬損傷毛發(fā)和健康毛發(fā)后，在兩種毛發(fā)上的吸附量由高至低依次為HA-GAT-LA＞HA-GAT＞HA。結(jié)果表明，在透明質(zhì)酸季銨鹽中引入乳酸基團(tuán)可進(jìn)一步提高透明質(zhì)酸在毛發(fā)上的附著，HA-GAT-LA具有更好的吸附性能，效果優(yōu)于HA和HA-GAT。

圖2 HA、HA-GAT和HA-GAT-LA在毛發(fā)上的吸附量

3.4 掃描電鏡觀察

結(jié)果見(jiàn)圖3。電鏡圖片顯示，健康毛毛鱗片規(guī)則整齊，貼附于毛桿，毛發(fā)表面光滑、突起較少。損傷毛毛鱗片變形，毛發(fā)表面粗糙、突起較多。經(jīng)供試液浸漬之后，毛發(fā)均有不同程度的修復(fù)，毛鱗片更加貼服，其中HA-GAT-LA浸漬的損傷毛發(fā)表面光滑程度接近健康毛發(fā)，修復(fù)效果明顯好于HA和HA-GAT。

圖3 HA、HA-GAT和HA-GAT-LA浸漬毛發(fā)的掃描電鏡圖片

3.5 頭發(fā)梳理試驗(yàn)

干梳摩擦阻力曲線和濕梳摩擦阻力分別見(jiàn)圖4、圖5，最大阻力見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，用加入HA-GATLA的洗發(fā)水清洗頭發(fā)之后，濕發(fā)和干發(fā)的摩擦阻力均明顯減小，表明HA-GAT-LA可顯著改善頭發(fā)的柔順度。

圖4 健康頭發(fā)干梳摩擦阻力曲線

圖5 健康頭發(fā)濕梳摩擦阻力曲線

表1 健康頭發(fā)濕梳和干梳的最大摩擦阻力

4 討論

由于HA具有良好潤(rùn)滑、保濕和生物相容性，被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域。為了適應(yīng)市場(chǎng)訴求的變化，研究者對(duì)HA分子進(jìn)行改性，研制出多種類型的產(chǎn)品，以達(dá)到消費(fèi)者、配方工程師對(duì)化妝品不同效果的需求。日本丘比公司通過(guò)化學(xué)修飾的方法將季銨陽(yáng)離子基團(tuán)引入HA，獲得的陽(yáng)離子化HA（即HA-GAT）可用于皮膚和毛發(fā)的保濕和修復(fù)[7]。本研究通過(guò)化學(xué)修飾的方法將季銨陽(yáng)離子乳酸鹽基團(tuán)引入HA，制備得到陽(yáng)離子化透明質(zhì)酸衍生物HA-GAT-LA，季銨陽(yáng)離子的引入改變了HA大分子表面的電荷，乳酸基團(tuán)的引入進(jìn)一步提高了HA的保濕和附著功能，效果優(yōu)于未引入乳酸基團(tuán)的HA-GAT，HA-GAT-LA能更好地吸附于毛發(fā)、皮膚的角質(zhì)表面，發(fā)揮高吸濕、保濕和修復(fù)效果，有效提高毛發(fā)的柔順度，使毛發(fā)更容易梳理，保護(hù)其避免損傷，有望開(kāi)發(fā)為新一代的日用化妝品原料。