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        麥冬皂苷B對結(jié)腸癌細胞增殖、凋亡的影響及其機制研究

        2021-01-08 01:33:16閆江濤高立偉左一凡
        食品與藥品 2020年6期
        關(guān)鍵詞:麥冬皂苷結(jié)腸癌

        閆江濤,高立偉,左一凡

        (平煤神馬醫(yī)療集團總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,河南 平頂山 467000)

        結(jié)腸癌是消化道常見惡性腫瘤,研究表明我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥在結(jié)腸癌治療中有明顯的增效減毒的優(yōu)勢,具有抑制結(jié)腸癌細胞系體外生長、增強機體免疫功能及促進細胞凋亡的作用[1]。麥冬皂苷B是從中藥麥冬中分離出的一種單體,研究表明其具有抗腫瘤作用,如麥冬皂苷B可誘導(dǎo)人肝癌HepG2細胞發(fā)生自噬[2]。麥冬皂苷B可能通過上調(diào)miR-34a的達抑制A549細胞增殖[3]。麥冬皂苷B可能通過激活JNK/c-Jun信號通路誘導(dǎo)細胞自噬、凋亡和細胞周期阻滯,從而抑制結(jié)腸癌的生長[4]。然而麥冬皂苷B影響結(jié)腸癌細胞增殖、凋亡的機制尚未完全清楚。有研究報道結(jié)腸癌組織中的微小RNA(miRNA)miR-142-3p的表達下調(diào)[5]。miR-142-3p高表達可在體內(nèi)抑制結(jié)腸癌細胞的生長[6]。本研究旨在研究麥冬皂苷B是否通過調(diào)控miR-142-3p影響結(jié)腸癌細胞的增殖和凋亡。

        1 材料與方法

        1.1 臨床資料

        選取本院2017年1月~2019年1月經(jīng)病理檢測為結(jié)腸癌且具有完整臨床病理資料的25例患者的癌組織及其相應(yīng)癌旁組織,患者術(shù)前未進行過手術(shù)及放化療,所有患者均知情且同意。

        1.2 儀器

        FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司);Thermo FC酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

        1.3 材料

        結(jié)腸癌細胞HT29(上海圻明);胎牛血清,RPMI-1640培養(yǎng)基(上海羽朵);麥冬皂苷B(純度≥97 %,上海谷研);細胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8,杭州仟諾);凋亡檢測試劑盒(上海經(jīng)科);RIPA蛋白裂解液(北京百奧萊博);熒光定量PCR試劑盒(上海滬震);cyclin D1抗體,cleaved-caspase-3抗體(美國Abbiotec公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔抗體(IgG-HRP)(美國AAT Bioquest公司)。

        1.4 細胞處理與分組

        結(jié)腸癌細胞HT29用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞,將其分別用10,20,40 μmol/L的麥冬皂苷B處理,正常培養(yǎng)的細胞作為對照(NC)組。

        將miR-142-3p模擬物陰性對照(miR-NC)、miR-142-3p模擬物、miR-142-3p抑制劑陰性對照(anti-miR-NC)、miR-142-3p抑制劑(anti-miR-142-3p)轉(zhuǎn)染至HT29細胞中,分別記為miR-NC組、miR-142-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-142-3p組;將anti-miR-NC、anti-miR-142-3p轉(zhuǎn)染至HT29細胞后再用40 μmol/L的麥冬皂苷B處理,記為麥冬皂苷B+anti-miR-NC組、麥冬皂苷B+anti-miR-142-3p組。

        1.5 CCK-8檢測細胞增殖活力

        選擇各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細胞,每孔加入10 μl CCK-8試劑,孵育2 h后,酶標(biāo)儀檢測各組細胞450 nm波長處的吸光度(OD)值。

        1.6 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測cyclin D1、cleaved-caspase-3蛋白表達

        提取各組細胞總蛋白,定量后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,室溫封閉90 min,加入cyclin D1和cleaved-caspase-3一抗,4 ℃孵育過夜,加入山羊抗兔IgG-HRP室溫孵育2 h,暗室中曝光顯影,定影,測定蛋白條帶灰度值,以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白質(zhì)相對表達水平。

        1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

        各組細胞培養(yǎng)48 h后用預(yù)冷的PBS漂洗2次,先加入10 μl 膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC),再加入5 μl 碘化丙啶(PI),混勻后避光孵育10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

        1.8 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-142-3p表達水平

        各組細胞培養(yǎng)48 h后提取細胞總RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,miR-142-3p以U6為內(nèi)參進行PCR擴增,每個樣品重復(fù)3次,循環(huán)條件為95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s,共40個循環(huán);60 ℃延長5 min。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。miR-142-3p上游引物序列:5'-GGGTGTAGTGTTTCCTACT-3',下游引物序列:5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3';U6上游引物序列:5'-TGCGGGTGCTCCGCTTCGGCAGC-3',下游引物序列:5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

        1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

        采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示,兩組比較行t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 不同濃度麥冬皂苷B對結(jié)腸癌細胞HT29增殖的影響

        與對照組相比,不同濃度麥冬皂苷B組結(jié)腸癌細胞HT29活性降低,cyclin D1相對表達水平顯著降低(P<0.05),結(jié)果見圖1、表1。

        圖1 Western Blot檢測cyclin D1蛋白的相對表達

        表1 不同濃度麥冬皂苷B對結(jié)腸癌細胞HT29增殖的影響( ±s,n=9)

        表1 不同濃度麥冬皂苷B對結(jié)腸癌細胞HT29增殖的影響( ±s,n=9)

        注:與NC比較,*P<0.05

        組別 OD450 cyclin D1相對表達量NC 0.869±0.10 0.83±0.08 10 μmol/L 麥冬皂苷B 0.690±0.08* 0.72±0.07*20 μmol/L 麥冬皂苷B 0.513±0.04* 0.57±0.05*40 μmol/L 麥冬皂苷B 0.431±0.03* 0.38±0.04*F 72.342 88.909 P 0.000 0.000

        2.2 麥冬皂苷B對結(jié)腸癌細胞HT29凋亡的影響

        與對照組相比,麥冬皂苷B(40 μmol/L)組結(jié)腸癌細胞HT29中cleaved-caspase-3表達水平顯著升高,細胞凋亡率顯著升高(P<0.05),見圖2、表2。

        圖2 麥冬皂苷B對結(jié)腸癌細胞HT29凋亡的影響

        表2 麥冬皂苷B對結(jié)腸癌細胞HT29凋亡的影響( ±s,n=9)

        表2 麥冬皂苷B對結(jié)腸癌細胞HT29凋亡的影響( ±s,n=9)

        注:與NC比較,*P<0.05

        NC 0.45±0.04 8.12±0.81麥冬皂苷B 0.93±0.09* 27.61±2.53*t 14.621 22.010 P 0.000 0.000

        2.3 麥冬皂苷B對miR-142-3p表達的影響

        與對照組相比,麥冬皂苷B組結(jié)腸癌細胞HT29中miR-142-3p表達水平顯著升高(P<0.05),見表3。

        表3 麥冬皂苷B對miR-142-3p相對表達量的影響( ±s,n=9)

        表3 麥冬皂苷B對miR-142-3p相對表達量的影響( ±s,n=9)

        注:與NC比較,*P<0.05

        組別 miR-142-3p相對表達量NC 1.00±0.12麥冬皂苷B 3.27±0.30*t 21.076 P 0.000

        2.4 miR-142-3p在結(jié)腸癌組織中表達情況

        與癌旁組織相比,結(jié)腸癌組織中miR-142-3p表達水平顯著降低(P<0.05),見表4。

        表4 miR-142-3p在結(jié)腸癌組織中相對表達量情況( ±s,n=25)

        表4 miR-142-3p在結(jié)腸癌組織中相對表達量情況( ±s,n=25)

        注:與癌旁組織比較,*P<0.05

        癌旁組織 1.00±0.11結(jié)腸癌組織 0.38±0.03*t 27.189 P 0.000

        2.5 miR-142-3p對結(jié)腸癌細胞HT29增殖、凋亡的影響

        與miR-NC組相比,miR-142-3p組miR-142-3p表達水平顯著升高,cyclin D1表達水平顯著降低,cleaved-caspase-3表達水平顯著升高,細胞增殖活性降低,細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與anti-miR-NC組相比,anti-miR-142-3p組miR-142-3p表達水平顯著降低,cyclin D1表達水平顯著升高,cleaved-caspase-3表達水平顯著降低,細胞增殖活性升高,細胞凋亡率顯著降低(P<0.05),見圖3,表5。

        2.6 miR-142-3p低表達對麥冬皂苷B對結(jié)腸癌細胞HT29增殖和凋亡的影響

        與麥冬皂苷B+anti-miR-NC組相比,麥冬皂苷B+anti-miR-142-3p組miR-142-3p表達水平顯著降低,cyclin D1表達水平顯著升高,cleaved-caspase-3表達水平顯著降低,細胞增殖活性升高,細胞凋亡率顯著降低(P<0.05),見圖4,表6。

        圖3 Western Blot檢測cyclin D1、cleavedcaspase-3蛋白的相對表達

        圖4 Western Blot檢測cyclin D1、cleavedcaspase-3蛋白的表達

        表5 miR-142-3p對結(jié)腸癌細胞HT29增殖、凋亡的影響( ±s,n=9)

        表5 miR-142-3p對結(jié)腸癌細胞HT29增殖、凋亡的影響( ±s,n=9)

        注:與miR-NC比較,*P<0.05;與anti-miR-NC比較,#P<0.05

        組別 miR-142-3p相對表達量cyclin D1相對表達量cleaved-caspase-3相對表達量 OD450 凋亡率/%miR-NC 1.00±0.11 0.85±0.08 0.46±0.05 0.857±0.12 8.09±0.81 miR-142-3p 3.28±0.30* 0.40±0.04* 0.95±0.09* 0.526±0.08* 21.49±2.01*anti-miR-NC 1.03±0.11 0.82±0.07 0.44±0.04 0.866±0.10 7.98±0.72 anti-miR-142-3p 0.48±0.04# 1.17±0.12# 0.15±0.02# 0.937±0.14# 3.23±0.27#t 483.801 131.604 314.476 24.143 420.824 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

        表6 miR-142-3p低表達對麥冬皂苷B對結(jié)腸癌細胞HT29增殖和凋亡作用的影響( ±s,n=9)

        表6 miR-142-3p低表達對麥冬皂苷B對結(jié)腸癌細胞HT29增殖和凋亡作用的影響( ±s,n=9)

        注:與麥冬皂苷B+anti-miR-NC比較,*P<0.05

        組別 miR-142-3p相對表達量cyclin D1相對表達量cleaved-caspase-3相對表達量 OD450 凋亡率/%麥冬皂苷B+anti-miR-NC 1.00±0.08 0.34±0.03 0.90±0.08 0.428±0.05 26.76±2.49麥冬皂苷B+anti-miR-142-3p 0.42±0.04* 0.72±0.07* 0.55±0.04* 0.715±0.09* 9.68±0.83*t 19.454 14.969 11.739 8.363 19.522 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

        3 討論

        目前的化學(xué)藥物治療結(jié)腸癌仍具有嚴重的毒、副作用,開發(fā)毒性低、副作用小的抗結(jié)腸癌藥物是研究的重點和熱點,而中草藥的有效活性成分是篩選抗癌藥物的重要來源,中藥治療結(jié)腸癌也逐漸成為了人們關(guān)注的重點[7-8]。研究報道麥冬皂苷B通過LINC00668/miR-432-5p上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)軸抑制A549細胞的轉(zhuǎn)移[9]。麥冬B素可在體內(nèi)和體外抑制A549細胞的轉(zhuǎn)移和血管生成[10]。麥冬皂苷B抑制人胃癌細胞SGC-7901增殖,促進細胞凋亡[11]。本研究結(jié)果顯示,麥冬皂苷B處理的結(jié)腸癌細胞HT29活性降低,cyclin D1表達水平顯著降低,cleaved-caspase-3表達水平顯著升高,細胞凋亡率顯著升高;cyclin D1是細胞周期相關(guān)蛋白,可影響細胞增殖;且研究報道cyclin D1在結(jié)腸癌中過度表達,與結(jié)腸癌的臨床病理特征緊密相關(guān)[12]。表明麥冬皂苷B可抑制結(jié)腸癌細胞HT29增殖,促進細胞凋亡。

        研究報道m(xù)iR-142-3p過表達抑制胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲,促進細胞凋亡[13]。miR-142-3p高表達可抑制乳腺癌細胞系的生長和轉(zhuǎn)移[14]。本實驗結(jié)果顯示,miR-142-3p在結(jié)腸癌組織中低表達,miR-142-3p高表達可抑制結(jié)腸癌細胞增殖、促進細胞凋亡。miR-142-3p低表達可促進結(jié)腸癌細胞增殖、抑制細胞凋亡。說明miR-142-3p在結(jié)腸癌中起抑癌作用。研究報道,通過上調(diào)miR-142-3p增強了結(jié)腸癌細胞對5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)的敏感性[15]。本研究結(jié)果表明,麥冬皂苷B處理的結(jié)腸癌細胞HT29中miR-142-3p表達水平顯著升高,而miR-142-3p低表達可抑制麥冬皂苷B對結(jié)腸癌細胞HT29增殖和凋亡的影響。說明麥冬皂苷B可能通過調(diào)控miR-142-3p影響結(jié)腸癌細胞的增殖、凋亡。

        綜上所述,麥冬皂苷B可通過上調(diào)miR-142-3p的表達抑制結(jié)腸癌細胞增殖、促進細胞凋亡,為結(jié)腸癌的中藥治療提供新思路和理論依據(jù)。

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