許學(xué)麗 ，宋 迪，王洪明，聶 磊

（1. 山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012；2. 濱州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 濱州 256600；3. 濱州市人民醫(yī)院，山東 濱州 256600）

炎可寧片為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第七冊(cè)收載品種，是一種臨床常用藥，由黃柏、大黃、黃芩、板藍(lán)根、黃連5味中藥組成，具有清熱瀉火，消炎止痢的功效[1]。目前不同廠家有多個(gè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但只有部分標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定有含量測(cè)定項(xiàng)，且只對(duì)其中的黃芩苷或鹽酸小檗堿有規(guī)定，不能有效控制產(chǎn)品質(zhì)量[2-3]。筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-10]，采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC），對(duì)炎可寧片中的9種有效成分鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚進(jìn)行含量測(cè)定，為更好控制炎可寧片的質(zhì)量提供了參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT型HPLC儀，包括紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、四元梯度泵等（日本Shimadzu公司）；KQ-300VDV 型超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）；BSG-12電熱恒溫水浴鍋（上海一恒）；CP225D電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 試劑試藥

炎可寧片（修正藥業(yè)，批號(hào)：170608，180404，180507，規(guī)格：0.3 g/片）；鹽酸小檗堿（批號(hào)：110713-201613，含量：86.8 %），黃芩苷（批號(hào)：110715-201619，含量：93.5 %），黃芩素（批號(hào)： 111595-201808，含量：97.9 %），蘆薈大黃素（批號(hào)：110795-201710，含量：98.3 %）、漢黃芩素（批號(hào)：111514-201605，含量：100.0 %），大黃酸（批號(hào)：110757-201607，含量：99.3 %），大黃素（批號(hào)：110756-201512，含量：98.7 %），大黃酚（批號(hào)：110796-201520，含量：99.2 %），大黃素甲醚（批號(hào)：110758-201415，含量：99.1 %）對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇，乙腈，磷酸等試劑均為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：InertSustain C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相：甲醇（A）-乙腈-（B）-0.2 %磷酸溶液（C），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表 1）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μl。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品各適量，加甲醇溶解并制成上述成分質(zhì)量濃度分別為41.9，81.6，24.7，2.53，4.98，1.13，2.51，6.79，2.97 μg/ml混合對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液 取本品 20片，除去糖衣，精密稱定，研細(xì)，取約0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 ml，稱定重量，超聲處理30 min（功率300 W，頻率45 kHz），取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按炎可寧片的處方比例，制備缺黃柏、大黃、黃芩和黃連的陰性樣品，并按2.2.2項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，進(jìn)樣量5 μl，并記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，在該色譜條件下，炎可寧片中的9個(gè)成分與其他色譜峰能達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于10 000，且陰性樣品對(duì)9個(gè)成分的測(cè)定無(wú)干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

取2.2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣1，2，5，8，10 μl，并記錄峰面積。以9個(gè)成分的進(jìn)樣量（x，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，見(jiàn)表2。炎可寧片中的9個(gè)成分在進(jìn)樣量范圍內(nèi)，r值均不小于0.9997，具有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：170608）適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.52 %，0.45 %，0.79 %，0.60 %，0.92 %，1.07 %，0.36 %，0.68 %，0.40 %（n=6），表明精密度良好。

圖 1 HPLC色譜圖

表2 回歸方程與線性范圍

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：170608），分別于室溫下放置0，3，6，9，12，24 h，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.82 %，0.48 %，0.95 %，0.72 %，0.64 %，1.16 %，1.03 %，0.96 %，0.77 %（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（批號(hào)：170608）粉末適量，共6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各待測(cè)成分含量。結(jié)果，鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為6.302，13.239，4.425，0.541，0.836，0.144，0.356，1.180，0.392 mg/g，RSD值分別為 0.63 %，0.36 %，0.55 %，1.02 %，0.90 %，1.28 %，0.75 %，0.84 %，0.50 %（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：170608）粉末約0.3 g，共6份，分別加入混合對(duì)照品溶液（鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的質(zhì)量濃度分別為1.911，4.025，1.350，0.1652，0.2550，0.04416，0.1088，0.3580，0.1202 mg/ml）1 ml，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.9 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各待測(cè)成分含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

0.3620 0.3580 0.7146 98.49 0.3546 0.3580 0.7130 100.11 0.3594 0.3580 0.7158 99.55 0.3643 0.3580 0.7189 99.05大黃素甲醚 0.1186 0.1202 0.2347 96.59 98.28 0.98 0.1180 0.1202 0.2360 98.17 0.1203 0.1202 0.2396 99.25 0.1178 0.1202 0.2365 98.75 0.1194 0.1202 0.2371 97.92 0.1210 0.1202 0.2400 99.00

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果/mg·g-1（n＝3）

3 討論

實(shí)驗(yàn)中曾考慮采用多波長(zhǎng)來(lái)測(cè)定炎可寧片中的9個(gè)有效成分，但經(jīng)使用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）分別對(duì)供試品溶液和混合對(duì)照品溶液中的待測(cè)成分進(jìn)行掃描后發(fā)現(xiàn)，在254 nm波長(zhǎng)處，9個(gè)待測(cè)成分均有較好吸收，且與其他色譜峰分離度較好，峰純度檢查結(jié)果也均能符合含量測(cè)定要求，陰性樣品對(duì)測(cè)定不存在干擾。因此最終選用單波長(zhǎng)254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，對(duì)HPLC儀的要求更低，且操作更簡(jiǎn)單。

曾采用多個(gè)流動(dòng)相進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，包括乙腈-0.1 %磷酸溶液，甲醇-0.1 %磷酸溶液等[2-7]，并對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行多次調(diào)整，進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果炎可寧片中的9個(gè)待測(cè)成分峰與其他色譜峰的分離度不能達(dá)到要求。參考有關(guān)文獻(xiàn)[8]，最終流動(dòng)相確定為甲醇-乙腈-0.2 %磷酸溶液，并對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行調(diào)整，梯度洗脫，結(jié)果9個(gè)待測(cè)成分峰與其他色譜峰的分離度均符合要求，且峰形均較好，理論板數(shù)均大于10 000。

炎可寧片供試品溶液的制備，分別采用超聲提取法和回流提取法試驗(yàn)。結(jié)果表明，取炎可寧片粉末，用甲醇作為溶劑，超聲提取30 min能做到提取完全，與加熱回流提取1 h的含量結(jié)果相當(dāng)。超聲提取操作更為方便簡(jiǎn)單，因此最終采用甲醇為溶劑超聲提取的方法。

本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定炎可寧片中9個(gè)成分含量的方法，分離度、重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，專屬性強(qiáng)，可為炎可寧片的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)提高提供參考。