羅華玲，林海霞

（樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 樂(lè)山 614000）

綠原酸的藥用歷史悠久，有抗氧化、抗菌、抗病毒、降糖、降脂、降血壓和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[1-3]。綠原酸主要存在于石韋、金銀花、菊花、杜仲葉等[4-6]藥材中，也是某些中藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，如小兒咽扁顆粒[7]等。綠原酸分子結(jié)構(gòu)中含酯鍵、不飽和鍵及多元酚，使綠原酸水溶液易受熱和光照而發(fā)生水解和氧化反應(yīng)[8-12]。上述藥品的含量測(cè)定項(xiàng)用高效液相色譜（HPLC）-外標(biāo)法測(cè)定綠原酸，但單支綠原酸對(duì)照品為20 mg，價(jià)格昂貴，且其化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，無(wú)法長(zhǎng)期保存，測(cè)定時(shí)需臨用新配。對(duì)照品替代法是現(xiàn)代分析技術(shù)中的一種新思路和新方法[13-16]。本文在參閱上述文獻(xiàn)及對(duì)照品替代法測(cè)定藥物含量報(bào)道的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了以價(jià)格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定的對(duì)乙酰氨基酚作為對(duì)照品替代，旨在解決對(duì)照物質(zhì)獲得困難、成本高和保管困難等問(wèn)題。本文以兩組分色譜峰相對(duì)保留時(shí)間為主、對(duì)乙酰氨基酚和綠原酸色譜峰紫外光譜為輔進(jìn)行定性，利用測(cè)得的相對(duì)校正因子計(jì)算各供試品中綠原酸的含量，并將測(cè)定結(jié)果與《中國(guó)藥典》2015年版一部收載外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（G4212B二極管陣列檢測(cè)器、G1311C四元泵、G1316A柱溫箱、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、OpenLAB CDS工作站，美國(guó)安捷倫公司）；PE-A10高效液相色譜儀（二極管陣列檢測(cè)器，珀金埃爾默公司）；Agilent 1290高效液相色譜儀（G4212A二極管陣列檢測(cè)器、G4204A四元泵、G1316C柱溫箱、G4226A自動(dòng)進(jìn)樣器、OpenLAB CDS工作站，美國(guó)安捷倫公司）；XSE205 DualRange電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；CQ-100B超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）。

1.2 試藥

對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品（100018-201610，99.9 %），綠原酸對(duì)照品（110753-201817，96.8 %），阿魏酸對(duì)照品（110773-201614，99.0 %），甘氨酸對(duì)照品（140689-201605，100 %），精氨酸對(duì)照品（140685-201707，99.9 %）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；石韋（市售飲片，四川某藥業(yè)有限公司，批號(hào)180801，170901，180901，180201；四川某制藥有限公司，批號(hào)1805303，1705005），小兒咽扁顆粒（市售，蘭州某股份有限公司、黑龍江某制藥有限公司，批號(hào)分別為20180922，181005），金銀花（市售飲片，四川某中藥有限公司，批號(hào)180301，180501；樂(lè)山某藥業(yè)有限公司，批號(hào)180301），菊花（市售飲片，成都某藥業(yè)有限公司，批號(hào)180501）；乙腈為色譜純，試驗(yàn)用水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜儀：PE-A10高效液相色譜儀-二極管陣列檢測(cè)器；色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，8 % A；9～15 min，8 %→30 % A；16～24 min，30 % A；24～30 min，30 %→ 8 % A）；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；流速1.0 ml/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μl。在上述色譜條件下理論板數(shù)分別以綠原酸和對(duì)乙酰氨基酚計(jì)，均不低于5000，相鄰峰之間分離度均大于1.5。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取綠原酸對(duì)照品10.60 mg，置入10 ml量瓶，用50 %甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為綠原酸對(duì)照品貯備溶液；精密稱取對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品10.73 mg，置入10 ml量瓶，用50 %甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品貯備溶液。分別精密量取綠原酸及對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品貯備液各0.5，1，2，5，10 ml，置入100 ml量瓶，用50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得線性系列混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制

（1）分別取石韋粉末（過(guò)二號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置入25 ml量瓶，再精密加入對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品貯備溶液0.5 ml，加入50 %甲醇適量，超聲處理（功率300 W，頻率25 kHz）45 min，放冷，用50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

（2）分別取金銀花粉末（過(guò)四號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置入50 ml量瓶，再精密加入對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品貯備溶液3 ml，加入50 %甲醇適量，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）30 min，放冷，用50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

（3）取菊花粉末（過(guò)一號(hào)篩）約0.25 g，精密稱定，置入25 ml量瓶，再精密加入對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品貯備溶液 1 ml，加入70 %甲醇適量，超聲處理（功率300 W，頻率45 kHz）40 min，放冷，用70 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

（4）取小兒咽扁顆粒的內(nèi)容物，混勻，取適量，研細(xì)，取約l g，精密稱定，置入50 ml量瓶，再精密加入對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品貯備溶液0.5 ml，加入50 %甲醇適量，超聲處理（功率 250 W，頻率25 kHZ）30 min，放冷，用50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品替代法方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，對(duì)乙酰氨基酚和綠原酸的理論板數(shù)均大于5000，綠原酸色譜峰峰形良好，供試品溶液色譜中綠原酸與相鄰峰的分離度均大于1.5。對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品、綠原酸對(duì)照品、阿魏酸對(duì)照品、甘氨酸對(duì)照品、精氨酸對(duì)照品液相色譜圖見(jiàn)圖1；混合對(duì)照品溶液及各供試品溶液（小兒咽扁顆粒、菊花、金銀花、石韋）液相色譜圖見(jiàn)圖2。該條件下阿魏酸、甘氨酸、精氨酸保留時(shí)間為17.094，15.723，8.114 min，由圖2可見(jiàn)，這幾處時(shí)間點(diǎn)均有雜質(zhì)峰干擾，無(wú)法測(cè)定，因此選擇對(duì)乙酰氨基酚作為替代對(duì)照品。

圖1 對(duì)照品HPLC圖譜

圖2 混合對(duì)照品及供試品HPLC圖譜

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取2.2.1項(xiàng)下線性系列溶液，照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，濃度X（μg/ml）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。分別得綠原酸回歸方程：Y=70 139X-29 383（r=1），線性范圍5.13～102.60 μg/ml；對(duì)乙酰氨其酚回歸方程：Y=35 654X-13 805（r=0.9999），線性范圍5.36～107.19 μg/ml，表明兩組分線性關(guān)系良好。

2.3.3 相對(duì)校正因子f的計(jì)算 采用斜率比值法，以2.3.2項(xiàng)峰面積（Y）與對(duì)照品濃度（X，μg/ml）進(jìn)行線性回歸，分別測(cè)定綠原酸和對(duì)乙酰氨基酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距校正為0后（Y=66 071X，Y=33 825X），兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值的倒數(shù)即為相對(duì)校正因子f，計(jì)算結(jié)果為0.5119。由此，對(duì)照品替代法測(cè)定樣品溶液中綠原酸濃度的計(jì)算公式為：Cm=f×Am×Cs/As。式中，Cm、Am分別為綠原酸濃度和面積，Cs、As分別為對(duì)乙酰氨基酚濃度和峰面積。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，照2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果綠原酸與對(duì)乙酰氨基酚色譜峰峰面積平均值（n=6）分別為6 776 310，3 727 016，RSD（n=6）分別為0.24 %和0.29 %。表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取石韋粉末，照2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別于配制后放置入0，2，4，8，12，24 h，照2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，計(jì)算得到24 h內(nèi)綠原酸色譜峰峰面積分別為630 897，631 054，629 750，628 345，627 121，625 848，RSD（n=6）為0.33 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

死不認(rèn)賬，是吧？你知道這張照片是誰(shuí)給我的嗎？是王鯰魚(yú)。他已經(jīng)把我給甩了，是老梅毀了我的幸福。王鯰魚(yú)還知道你是老梅的鴨子。老梅每個(gè)月給你兩千塊錢(qián)，對(duì)不對(duì)？

2.3.6 重復(fù)性 取石韋粉末，照2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法平行制備6份供試品溶液，照2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，以對(duì)照品替代法計(jì)算6份供試品溶液中綠原酸的平均含量（n=6）為0.116 %，RSD（n=6）為0.7 %，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.7 準(zhǔn)確度 取石韋粉末（過(guò)二號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置入25 ml量瓶，分別精密加入對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品貯備液（107.19 μg/ml）2 ml和綠原酸對(duì)照品貯備溶液（102.60 μg/ml）2 ml，加入50 %甲醇適量，超聲處理（功率300 W，頻率25 kHz）45 min，放冷，用50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，平行制備6份，照2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，分別按對(duì)照品外標(biāo)法和對(duì)照品替代法計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果平均回收率分別為98.33 %和98.65 %（n=6），RSD為1.34 %和1.30 %。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 相對(duì)校正因子的耐用性考察

表1 綠原酸回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

表2 不同儀器及不同品牌色譜柱測(cè)得的相對(duì)校正因子

2.4.1 不同儀器及不同品牌色譜柱的考察 實(shí)驗(yàn)分別考察采用PE-A10高效液相色譜儀、Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 1290高效液相色譜儀，分別用Kromail 100-5-C18（250 mm×4.0 mm，5 μm，1號(hào)柱）、Agilent 5 TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm，2號(hào)柱）、Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，3號(hào)柱）、Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，4號(hào)柱） 共4根色譜柱，測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚對(duì)綠原酸的相對(duì)校正因子f，結(jié)果表明，不同儀器及不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響不顯著，表明相對(duì)校正因子在不同儀器及不同品牌色譜柱下有好的耐用性。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.2 不同流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響 照2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，考察流速為0.8，1.0，1.2 ml/min的相對(duì)校正因子，結(jié)果分別為0.5118，0.5241，0.5128，RSD（n=3）為1.32 %，表明相對(duì)校正因子在一定的流速范圍內(nèi)有良好的適用性。

2.4.3 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響 照2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，考察柱溫為25，30，35 ℃的相對(duì)校正因子，結(jié)果分別為0.5128，0.5189，0.5035，RSD（n=3）為1.52 %，表明相對(duì)校正因子在適宜的柱溫范圍內(nèi)有良好的適用性。

2.4.4 不同測(cè)定波長(zhǎng)對(duì)相對(duì)校正因子的影響 照2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，考察測(cè)定波長(zhǎng)為236，240，244 nm的相對(duì)校正因子，結(jié)果分別為0.5087，0.5201，0.5104，RSD（n=3）為1.20 %，表明在同一臺(tái)液相色譜儀上，測(cè)定波長(zhǎng)變化4 nm，對(duì)f值影響不大。

2.5 對(duì)照品替代法法待測(cè)成分色譜峰的定位

2.6 對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品穩(wěn)定性試驗(yàn)

將2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品貯備溶液于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h后，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，色譜峰面積RSD為0.56 %，表明對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 含量測(cè)定

分別收集4個(gè)品種共12批次樣品，按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，照2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別用對(duì)照品外標(biāo)法和對(duì)照品替代法計(jì)算12批樣品綠原酸含量，并將兩結(jié)果進(jìn)行比較，驗(yàn)證替代對(duì)照法計(jì)算含量的準(zhǔn)確性，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，2種方法測(cè)定的結(jié)果無(wú)顯著性差異，表明以對(duì)乙酰氨基酚為對(duì)照品替代可用于石韋、金銀花、菊花、小兒咽扁顆粒中綠原酸含量的測(cè)定。

3 討論

3.1 對(duì)照品替代法的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別考察了對(duì)乙酰氨基酚、阿魏酸、甘氨酸、精氨酸與綠原酸的色譜保留時(shí)間及分離情況。各供試品在阿魏酸、甘氨酸、精氨酸保留時(shí)間點(diǎn)均出現(xiàn)干擾峰，所以選擇對(duì)乙酰氨基酚作為綠原酸含量測(cè)定的對(duì)照品替代。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=6）

3.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)綠原酸和對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品的紫外光譜圖，見(jiàn)圖3。可見(jiàn)綠原酸在240 nm、326 nm波長(zhǎng)處有吸收峰；對(duì)乙酰氨基酚在244 nm波長(zhǎng)處有吸收峰。在326 nm波長(zhǎng)處測(cè)定的相對(duì)校正因子為0.1429；在240 nm波長(zhǎng)處測(cè)定值為0.5119，根據(jù)中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)替代測(cè)定法技術(shù)指導(dǎo)原則，相對(duì)校正因子應(yīng)接近1，一般不超過(guò)0.2～5[13]，因此本實(shí)驗(yàn)選定測(cè)定波長(zhǎng)為240 nm。

圖3 綠原酸和對(duì)乙酰氨基酚紫外光譜圖

3.3 色譜峰的定性

本文使用以兩組分色譜峰相對(duì)保留時(shí)間為主、對(duì)乙酰氨基酚和綠原酸色譜峰紫外光譜為輔的定性方法，通過(guò)計(jì)算乙酰氨基酚和綠原酸的相對(duì)保留時(shí)間，預(yù)確定待測(cè)成分的位置；再通過(guò)比對(duì)待測(cè)成分與標(biāo)準(zhǔn)光譜圖的一致性進(jìn)行輔助定位，提高待測(cè)成分色譜峰定位的準(zhǔn)確度。

3.4 綠原酸溶液的穩(wěn)定性

綠原酸對(duì)照品大多以50 %甲醇配制，并置棕色量瓶中避光保存，即使如此，本實(shí)驗(yàn)仍發(fā)現(xiàn)，當(dāng)綠原酸溶液存儲(chǔ)一周后，其峰面積下降約1 %；存儲(chǔ)一個(gè)月后，其峰面積下降約20 %，液相色譜圖可見(jiàn)綠原酸峰旁有較大的降解雜質(zhì)峰。文獻(xiàn)報(bào)道，綠原酸溶液在中性或堿性環(huán)境下含量明顯降低，而在酸性條件下含量變化不大，在pH 2～4較穩(wěn)定[12]；另外光線對(duì)綠原酸水溶液穩(wěn)定性的影響也較大，貯存和測(cè)定時(shí)應(yīng)注意避光[9]。

3.5 色譜峰的確認(rèn)

現(xiàn)有文獻(xiàn)中對(duì)照品替代法色譜峰的定位多采用相對(duì)保留時(shí)間法，但在實(shí)際操作中，使用不同品牌和規(guī)格色譜柱時(shí)，相對(duì)保留時(shí)間會(huì)有一定變化。根據(jù)本研究色譜峰的定性方法，需確認(rèn)樣品溶液色譜圖中在對(duì)照品替代法色譜峰的位置是否有其他物質(zhì)色譜峰干擾，應(yīng)采用色譜峰純度檢查進(jìn)行確認(rèn)。

4 小結(jié)

本研究采用對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品替代法法，用于石韋、金銀花、菊花、小兒咽扁顆粒中綠原酸含量的測(cè)定，確定了對(duì)乙酰氨基酚和綠原酸的相對(duì)校正因子，對(duì)其耐用性進(jìn)行考察，將測(cè)定結(jié)果與對(duì)照品外標(biāo)法進(jìn)行比對(duì)，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明：不同儀器和不同色譜柱、不同流速、不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子f值無(wú)顯著影響。對(duì)照品外標(biāo)法和對(duì)照品替代法結(jié)果無(wú)顯著性差異。本研究認(rèn)為，對(duì)于石韋、金銀花、菊花、小兒咽扁顆粒中綠原酸含量的測(cè)定，已建立的對(duì)乙酰氨基酚與綠原酸之間的相對(duì)校正因子具有較高的可信度，可用對(duì)乙酰氨基酚替代價(jià)格貴、化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的綠原酸。以對(duì)乙酰氨基酚代替綠原酸作為對(duì)照品，采用HPLC法測(cè)定綠原酸的含量進(jìn)行質(zhì)量控制，是經(jīng)濟(jì)、可行、實(shí)用的，可用于含綠原酸成分的中藥飲片及中成藥的含量測(cè)定。