方歡樂，于晉茹 ，陶炎炎 ，張 慧，劉建利

（西安培華學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710125）

目前，隨著老年人口的迅速增加[1]，衰老相關(guān)疾病發(fā)病率也在不斷增長[2]。生物體的衰老過程主要表現(xiàn)為機(jī)體組織和細(xì)胞中自由基累積。自由基是正常代謝的中間產(chǎn)物，其反應(yīng)能力強(qiáng)，可使細(xì)胞中多種物質(zhì)發(fā)生氧化，損害生物膜，還可引發(fā)DNA的損傷，進(jìn)一步誘發(fā)腫瘤等疾病。隨著年齡的增長，人體的自由基防御能力減弱。

葡萄籽的提取物葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidin extract，GSPE）具有增強(qiáng)心血管活性、抗氧化、抗衰老等多種生物活性和藥理作用[3]。GSPE用于食品中能有效清除體內(nèi)自由基，防治與自由基相關(guān)的心血管等疾病[4]；在化妝品中使用也可使皮膚老化減慢[5]。

研究顯示模擬自然衰老過程公認(rèn)的研究方法是持續(xù)注射一定量D-半乳糖[6]。本研究采用D-半乳糖建立小鼠衰老模型，檢測葡萄籽原花青素對衰老小鼠的抗氧化功效，探討葡萄籽原花青素的抗衰老作用，為其在抗衰老方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AE224電子天平（上海恒平）；SG-4054恒溫水浴鍋（上海碩光）；JJ-2高速組織搗碎機(jī)（上海凈信科技）；XSP-9CA光學(xué)顯微鏡（上海光學(xué)儀器一廠）； Varioskan Flash全波長掃描多功能讀數(shù)儀（美國Thermo Scientific公司）。

1.2 材料

葡萄籽原花青素提取物（GSPE，陜西惠科植物有限公司，純度大于95 %）；D-半乳糖粉劑（上海國藥集團(tuán)，批號：20061025）；維生素C注射液[華潤雙鶴利民藥業(yè)（濟(jì)南）有限公司，批號：H20023350]；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒，丙二醛（MDA）檢測試劑盒，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒，羥脯氨酸（HYP）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：20190514）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性昆明種小鼠60只，20～22 g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號：SCXK（陜）2010-001，動(dòng)物使用許可證號：SYXK（陜）2018-001。溫度22±2 ℃，相對濕度55 %±15 %，12 h:12 h暗/光循環(huán)條件下飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及造模給藥

健康雄性小鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為6組即空白組、模型組、GSPE低（100 mg/kg）、中（200 mg/kg）、高（400 mg/kg）劑量組、維生素C陽性對照組（100 mg/kg），每組10只。將配制好的D-半乳糖溶液皮下注射于小鼠頸部（0.1 ml/10 g），空白對照組頸部皮下注射等體積的生理鹽水，連續(xù)注射30 d致小鼠衰老。造模同時(shí)各給藥組灌胃給予相應(yīng)濃度的藥物溶液，空白對照組和模型對照組給予生理鹽水20 ml/kg，每日1次，連續(xù)8周。每周稱重一次。

2.2 臟器系數(shù)測定

末次給藥后禁食24 h，稱取小鼠體重。眼球取血并分離血清。處死小鼠，摘取肝臟、脾臟、胸腺組織，生理鹽水洗凈各臟器組織，吸水紙吸干水分后，稱重，按下式計(jì)算各臟器組織臟器系數(shù)。

臟器系數(shù)=臟器重量（mg）/小鼠體重（g）

2.3 肝臟、皮膚組織及血清生化指標(biāo)檢測

眼球取血，3500 r/min離心20 min后，分離血清，采用試劑盒測定各組小鼠血清中SOD、MDA、GSH-Px含量。取小鼠肝臟和皮膚組織加入冰浴過的生理鹽水制備10 %的組織勻漿2 ml，12 000 r/min 低溫離心10 min，分離上清，采用試劑盒測定小鼠血清及肝臟、皮膚組織勻漿液中SOD、MDA、GSH-Px含量。同時(shí)檢測皮膚組織中羥脯氨酸（HYP）的含量。

2.4 肝臟組織切片觀察

取小鼠部分肝臟組織，固定于10 %甲醛溶液中，依次經(jīng)80 %，90 %，95 %，100 %酒精脫水。石蠟包埋，切片機(jī)切片，蘇木素-伊紅染色，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察肝臟組織細(xì)胞形態(tài)的變化。

2.5 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果與分析

3.1 GSPE對衰老小鼠臟器系數(shù)的影響

與正常組小鼠比較，模型組小鼠的脾臟、胸腺系數(shù)顯著減小，肝臟系數(shù)顯著增大（P＜0.01）；與模型組比較，GSPE 400 mg/kg組和維生素C組小鼠脾臟、胸腺系數(shù)顯著增大，肝臟系數(shù)顯著減少（P＜0.01），200 mg/kg劑量組脾臟系數(shù)增大（P＜0.05），而100 mg/kg劑量組3個(gè)臟器系數(shù)均無明顯變化。結(jié)果見表1。

表1 GSPE對衰老小鼠臟器系數(shù)的影響（n=10，±s）

表1 GSPE對衰老小鼠臟器系數(shù)的影響（n=10，±s）

注：**P＜0.01 vs 正常組；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 模型組

肝臟/mg·g-1正常組 - 2.94±0.63 4.12±0.79 34.84±4.52模型組 - 2.07±0.42** 2.72±0.87**43.14±4.93**低劑量組 100 2.09±0.74 2.76±1.14 39.73±8.48中劑量組 200 2.41±0.37# 3.22±0.98 36.32±8.33高劑量組 400 2.66±0.61## 3.97±1.03##35.77±5.52##維生素C 100 2.76±0.33## 4.262±0.61##33.77±3.52##組別 劑量/mg·kg-1脾臟/mg·g-1胸腺/mg·g-1

3.2 GSPE對衰老小鼠血清SOD、MDA、GSH-Px含量的影響

與正常組小鼠比較，模型組小鼠血清中SOD、GSH-Px含量降低，MDA含量明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，GSPE 400，200 mg/kg劑量組和維生素C組血清SOD、GSH-Px含量升高，MDA含量降低（P＜0.05，P＜0.01）。100 mg/kg劑量組各指標(biāo)無明顯變化。結(jié)果見表2。

表2 GSPE對衰老小鼠血清SOD、MDA、GSHPx含量的影響（n=10，x ±s）

3.3 GSPE對衰老小鼠肝臟SOD、MDA、GSH-Px含量的影響

與正常組小鼠比較，模型小鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px含量降低，MDA含量明顯增加。與模型組相比，GSPE 400 mg/kg組和維生素C組肝臟組織中的SOD、GSH-Px含量均升高，MDA含量降低（P＜0.05，P＜0.01）；200 mg/kg組肝臟組織中GSH-Px含量升高，MDA含量降低（P＜0.05，P＜0.01）。100 mg/kg劑量組各指標(biāo)無明顯變化。結(jié)果見表3。

表3 GSPE對衰老小鼠肝臟中SOD、MDA、GSH-Px含量的影響（n=10，±s）

表3 GSPE對衰老小鼠肝臟中SOD、MDA、GSH-Px含量的影響（n=10，±s）

注：**P＜0.01 vs 正常組；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 模型組

正常組 - 140.56±25.58 11.04±1.44 542.00±22.10模型組 - 110.11±24.27**13.85±1.83**400.12±18.10**低劑量組 100 119.56±41.40 12.67±0.86 433.12±18.10中劑量組 200 118.67±25.20 11.69±0.93#483.12±18.10##高劑量組 400 133.11±30.27#11.91±0.86##533.12±18.10##維生素C 100 140.22±16.21##11.75±1.36##538.12±15.10##

3.4 GSPE對衰老小鼠皮膚組織中SOD、GSH-Px、HYP含量的影響

與正常組小鼠比較，模型組小鼠皮膚組織中SOD、GSH-Px含量降低，HYP含量明顯增加。與模型組相比，GSPE 400 mg/kg組和維生素C組小鼠皮膚組織中的SOD、GSH-Px含量升高，200 mg/kg組小鼠皮膚組織中HYP含量降低，GSH-Px含量升高（P＜0.05，P＜0.01），HYP含量降低（P＜0.01）。100 mg/kg劑量組各指標(biāo)無明顯變化。結(jié)果見表4。

表4 GSPE對衰老小鼠皮膚組織中SOD、GSHPx、HYP含量的影響（n=10，x ±s）

3.5 GSPE對衰老小鼠肝臟組織切片觀察分析

組織病理學(xué)結(jié)果見圖1。由圖1可見，正常組肝細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞形態(tài)正常；模型組肝細(xì)胞擴(kuò)張，排列紊亂，有炎癥細(xì)胞浸潤；GSPE 200，400 mg/kg組和維生素C組小鼠較模型組有很大的改善，肝臟細(xì)胞形態(tài)和排列趨于正常，炎癥情況減輕。

圖1 各組小鼠肝臟光鏡下病理形態(tài)學(xué)改變（HE×400）

4 討論

老齡化的衰老涉及機(jī)體多個(gè)組織和器官，是一種漸進(jìn)的生理功能障礙過程。D-半乳糖誘導(dǎo)的急性衰老模型，在生理、生化等指標(biāo)上能有效模擬自然衰老，用量過大可引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激、細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)等，加速大腦衰老和認(rèn)知功能障礙[7]，出現(xiàn)心肌細(xì)胞鈣超載、凋亡、心臟功能退化[8]，肝臟細(xì)胞復(fù)制性衰老、肝臟結(jié)構(gòu)破壞、炎性細(xì)胞增多[9]、同時(shí)免疫系統(tǒng)也被破壞，胸腺、脾臟指數(shù)下降[10]。本研究采用D-半乳糖注射建立小鼠衰老模型，觀察GSPE對小鼠衰老的干預(yù)作用。結(jié)果顯示，GSPE可改善衰老所導(dǎo)致的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)下降，與模型對照組比較，GSPE中、高劑量組脾臟、胸腺、肝臟指數(shù)顯著改善，組織病理學(xué)結(jié)果顯示，GSPE中、高劑量組肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞數(shù)量增加，說明GSPE對D-半乳糖誘發(fā)的肝臟細(xì)胞損傷也有抑制效果。

衰老會導(dǎo)致體內(nèi)自由基防御系統(tǒng)逐漸下降，如SOD、GSH-Px等酶的活力下降[9]。SOD是機(jī)體內(nèi)清除自由基的主要物質(zhì)，生物體中SOD的水平是象征著衰老和死亡的直觀指標(biāo)[11]；GSH-Px是一種重要的體內(nèi)過氧化物分解酶，是生物抗氧化能力的指標(biāo)之一[12]。測定 SOD、GSH-Px酶活力變化可間接反應(yīng)機(jī)體的衰老程度。生物體中，自由基作用于脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物是MDA，MDA的大量產(chǎn)生加重了細(xì)胞膜的損傷[13]。本研究顯示模型對照組小鼠血清、肝臟及皮膚組織中的SOD、GSH-Px含量顯著降低，MDA含量升高，應(yīng)用中、高劑量GSPE進(jìn)行治療后小鼠血清、皮膚、肝臟中的SOD、GSHPx 酶活性顯著升高、MDA含量降低，進(jìn)一步證明GSPE可通過對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)改善衰老。

HYP是膠原纖維和膠原蛋白中主要的非必需氨基酸，是檢測機(jī)體膠原代謝的重要指標(biāo)，也是評價(jià)皮膚衰老的重要指標(biāo)[14]。本研究進(jìn)一步測定了衰老小鼠皮膚組織中HYP的含量。研究顯示，與空白對照組比較，模型對照組皮膚組織中HYP的含量明顯升高，用中、高劑量GSPE進(jìn)行治療后皮膚組織HYP的含量降低。

總之，研究結(jié)果顯示GSPE具有抗氧化、預(yù)防衰老的作用，可為葡萄籽相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供更多的選擇。