齊香玉，陳雙雙，馮 景，王華娣，鄧衍明,

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 休閑農(nóng)業(yè)研究所，江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014；2.江蘇大學 生命科學學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

實時熒光定量PCR(qRT-PCR)是研究基因表達的一項重要技術(shù)，通過對內(nèi)參基因的檢測從而達到對目的基因表達情況的實時監(jiān)測[1]。qRT-PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強和重復(fù)性好等優(yōu)點，得到了廣泛應(yīng)用。但該技術(shù)對樣品RNA的質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄的效率、內(nèi)參基因選擇及引物特異性等都有著非常嚴格的要求[2]。其中，qRT-PCR分析結(jié)果準確可靠的前提是合適內(nèi)參基因的選擇。常用的內(nèi)參基因包括EF1α(Elongation factor 1 alpha)、Actin(Actin-7)、GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、PP2A(Protein phosphatase 2A)、TIP41(TIP41-like family protein)、UPL7(E3 ubiquitin-protein ligase UPL7)、PEPKR1(Phosphoenolpyruvate carboxylase-related Kinase 1)、SAND(SAND family protein)和TUB(Tubulin)等[3-4]。理想的內(nèi)參基因在植物不同生長發(fā)育階段、不同組織中均能穩(wěn)定表達，不受環(huán)境影響[5]。但研究表明，在不同植物中、不同時間及處理條件下，內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性存在較大差異，如Actin在側(cè)柏各組織中有較好的穩(wěn)定性表達[6]，但其表達穩(wěn)定性在柚木各組織中卻較差[7]；18SrRNA在黃山欒樹不同組織中表達穩(wěn)定性較好[8]，但在珙桐各器官中表達穩(wěn)定性較差[9]。如直接使用未經(jīng)篩選的內(nèi)參基因，會導致試驗數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差，影響目的基因表達水平的分析[10]。因此，為了確保qRT-PCR分析結(jié)果可靠準確，針對不同植物、組織、生長發(fā)育階段及試驗條件等因素，應(yīng)對內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性進行評價從而篩選出適宜的內(nèi)參基因。

茉莉花(Jasminumsambac(L.)Aiton)又名茉莉、茶葉花，為木樨科(Oleaceae)素馨屬常綠灌木。茉莉花原產(chǎn)于印度、巴基斯坦等地，在1 700多年前的漢代傳入我國，最早在東南沿海地區(qū)栽培，然后漸次北上直到長江流域，現(xiàn)主要分布在廣西、福建、四川、廣東等地，是“一路一帶”經(jīng)濟植物開發(fā)與應(yīng)用的重要成員之一[11]。茉莉花具有較高的觀賞、茶用和藥用價值，歷來受到我國人民的喜愛，被譽為“天下第一香”、“花樹中的珍品”[12]。茉莉花因馥郁及優(yōu)雅的香氣而被稱為“精油之王”，廣泛用于花茶和香精加工產(chǎn)業(yè)。目前，對茉莉花分子生物學方面的研究日益增多，基因表達分析已被應(yīng)用于茉莉花香氣基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究中[13]，如JsDXR和JsTPS在花發(fā)育不同階段及花不同部位的表達水平[14]、α-法呢烯合成相關(guān)的HMGS、HMGR、FPPS、TPS基因在茉莉花不同花期的表達情況的研究[15]等。研究茉莉花香氣合成代謝通路中的關(guān)鍵基因，明確其調(diào)控分子機制將有助于對香氣成分進行調(diào)控。茉莉花基因表達的研究必須要有合適的內(nèi)參基因作為參照，但目前關(guān)于茉莉花內(nèi)參基因的研究尚未見報道。因此，本研究選取8個常用候選內(nèi)參基因(EF1α、GAPDH、Actin、PP2A、TIP41、UPL7、PEPKR1和SAND)，研究其在茉莉花不同組織和花發(fā)育不同時期的表達水平，并借助geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder軟件對這些內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性進行評價，進一步利用目的基因?qū)Y選獲得的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性和可靠性進行驗證。本研究結(jié)果為后續(xù)茉莉花基因表達、功能及調(diào)控等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為多年生雙瓣茉莉花，種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院茉莉花種質(zhì)資源圃。不同組織樣品分別取自根、莖、嫩葉、成熟葉和花；花發(fā)育不同階段樣品取樣參照Deng等[16]分別取階段Ⅰ(幼蕾期)、階段Ⅲ(膨大花蕾期)、階段Ⅴ(最長花蕾期)和階段Ⅵ(初綻期)4個時期。每個樣品設(shè)置3個生物學重復(fù)，液氮速凍后置-80 ℃冰箱保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 用RNA提取試劑盒(TaKaRa, 日本)提取樣品總RNA?？俁NA樣品用DNaseⅠ(TaKaRa, 日本)消化去除基因組DNA污染。利用ND-1000 spectrophotometer(NanoDrop, Wilmington，DE)和1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA濃度、純度和完整性。取各樣品1 000 ng的RNA為模板，按照PrimeScript 1st strand cDNA synthesis kit(TaKaRa, 日本)的操作方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA置于-20 ℃保存。

1.2.2 候選內(nèi)參基因選擇及引物設(shè)計 根據(jù)繡球與宿根花卉研究室前期茉莉花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，選擇較常見的8個候選內(nèi)參基因：EF1α、GAPDH、Actin、PP2A、TIP41、UPL7、PEPKR1和SAND。根據(jù)候選內(nèi)參基因序列及引物設(shè)計原則，運用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計內(nèi)參基因的引物(表1)，并由南京思普金生物科技有限公司合成。

表1 茉莉花候選內(nèi)參基因引物序列

1.2.3 候選內(nèi)參基因引物特異性分析 用內(nèi)參基因qRT-PCR引物，以茉莉花各樣品cDNA等量混合為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)的體系為25.0 μL：cDNA模板1.0 μg、上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL、TaKaRa Taq(5 U/μL)0.2 μL、10× PCR Buffer 2.5 μL、dNTP(2.5 mmol/L each)2.0 μL，加水至25.0 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。通過2%的瓊脂糖凝膠電泳對引物的特異性進行檢測。

1.2.4 內(nèi)參基因的qRT-PCR分析 qRT-PCR擴增采用TaKaRa公司的TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)試劑盒，具體操作按說明書進行。cDNA稀釋10倍作為模板，反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板2.0 μL、TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL、ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)在實時熒光定量PCR儀ABI 7500上進行，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環(huán)；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，95 ℃變性15 s。每個樣品設(shè)3個生物學重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理和分析 qRT-PCR后得出Ct值，分別利用geNorm[17-18]、NormFinder[19]和BestKeeper[20]軟件對Ct值進行分析，對8個內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性進行比較，并從中選擇最適內(nèi)參基因。使用RefFinder程序?qū)σ陨?種軟件的分析結(jié)果進行綜合分析，選出最適于茉莉花不同組織和花發(fā)育不同階段的內(nèi)參基因[21]。

1.2.6 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗證 通過對茉莉花花香氣形成過程中的5-磷酸脫氧木酮糖合成酶(DXS，Deoxyoxylulose-5-phosphate synthase)基因JsDXS和苯丙氨酸解氨酶(PAL，phenylalanine ammonia lyase)基因JsPAL2在花發(fā)育不同階段的表達模式進行分析，從而對篩選的內(nèi)參基因穩(wěn)定性和可靠性進行驗證?；騄sDXS和JsPAL2qRT-PCR分析的引物序列分別參考孫君等[22]、熊青等[23]文獻報道中的引物序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量檢測及引物特異性分析

NanoDrop檢測各樣品總RNA的OD260/280均在1.95～2.13，OD260/230均大于2.0，說明總RNA的純度較好。通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品總RNA完整性，所有樣品28S rRNA和18S rRNA條帶清晰完整，說明總RNA的完整性較好，達到后續(xù)試驗的需求。

以各樣品cDNA等量混合為模板，對8個內(nèi)參基因進行PCR擴增。凝膠電泳結(jié)果顯示，8個候選內(nèi)參基因均擴增出單一條帶，無非特異擴增及引物二聚體，且擴增條帶大小符合預(yù)期(圖1)，說明設(shè)計的引物特異性好，可用于qRT-PCR試驗。

圖1 茉莉花8個候選內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物

將各樣品cDNA等量混合后，稀釋10倍作為模板，分別用8個候選內(nèi)參基因引物進行qRT-PCR擴增，結(jié)果如圖2所示。各候選內(nèi)參基因溶解曲線均只有明顯的單一峰，說明8個候選內(nèi)參基因引物擴增特異性強，符合qRT-PCR試驗要求，可用于后續(xù)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的分析。

圖2 茉莉花8個候選內(nèi)參基因qRT-PCR溶解曲線

2.2 候選內(nèi)參基因表達分析

分別以茉莉花不同組織和花發(fā)育不同階段cDNA為模板，進行qRT-PCR分析。結(jié)果如圖3所示，8個候選內(nèi)參基因在茉莉花不同樣品中的Ct值均有一定的變化，變化的趨勢各有不同。EF1α在不同樣品的Ct值在19.09～23.27，GAPDH的Ct值在17.89～31.26，Actin的Ct值27.88～29.20，PP2A的Ct值在22.16～34.03，TIP41的Ct值在22.31～33.51，UPL7的Ct值在23.47～31.39，PEPKR1的Ct值在26.96～29.98，SAND的Ct值在25.54～31.20。除Actin外，其他所有候選內(nèi)參基因在花中的Ct值均高于其他組織，即在花中的表達量均最低。因各候選內(nèi)參基因的Ct值(除Actin)在花與其他組織中的差異較大，對后期結(jié)果影響較大，故在候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價中，將不同組織分為“有花組”(包含根、莖、嫩葉、成熟葉、花)和“無花組”(包含根、莖、嫩葉、成熟葉)進行分析。8個候選內(nèi)參基因平均Ct值為21.53～28.68，其中EF1α的Ct值最小，說明其表達豐度較高(圖4)。

Ⅰ.幼蕾期；Ⅲ.膨大花蕾期；Ⅴ.最長花蕾期；Ⅵ.初綻期。圖7同。

箱體內(nèi)的線表示中位數(shù)；箱體下、上邊分別表示25%，75%的百分位數(shù)；箱體上、下豎線分別表示最大值與最小值。

2.3 候選內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性分析

2.3.1 geNorm分析 geNorm軟件依據(jù)計算的每個基因表達穩(wěn)定性M值來進行排序，M值越小穩(wěn)定性越好，反之則穩(wěn)定性越差，M<1.5時認為是理想內(nèi)參。geNorm軟件分析結(jié)果顯示，在有花組中，EF1α、SAND、PEPKR1、UPL7的M值小于1.5，說明這些內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性較好，表達的穩(wěn)定性由高到低排序依次為：EF1α=SAND>PEPKR1>UPL7>TIP41>PP2A>Actin>GAPDH(圖5-A)；在無花組中，各候選內(nèi)參基因M值均小于1.5，說明8個內(nèi)參基因均具有良好的穩(wěn)定性，表達穩(wěn)定性由高到低排序依次為：GAPDH=UPL7>TIP41>EF1α>PP2A>SAND>PEPKR1>Actin(圖5-B)；在花發(fā)育不同階段，各基因M值均小于1.5，說明8個內(nèi)參基因均具有良好的穩(wěn)定性，表達穩(wěn)定性由高到低排序依次為：EF1α=Actin>PEPKR1>GAPDH>SAND>TIP41>UPL7>PP2A(圖5-C)。

A.不同組織(有花組)；B.不同組織(無花組)；C.花發(fā)育不同階段。圖6同。

geNorm通過對配對差異分析(Vn/Vn+1)得出最佳內(nèi)參基因個數(shù)，軟件默認的Vn/Vn+1閾值為0.15，Vn/Vn+1比值小于0.15時，最適內(nèi)參基因為n個；大于0.15時，最適內(nèi)參基因為n+1個。對候選內(nèi)參基因的配對差異值分析發(fā)現(xiàn)，在有花組中，Vn/Vn+1值均大于0.15，此時不能依靠閾值(0.15)來決定最適內(nèi)參基因的個數(shù)，評估目的基因在茉莉花不同組織中的表達水平時，選取2～3個穩(wěn)定性強的內(nèi)參基因即可(圖6-A)；在無花組中，V2/V3=0.087<0.15，說明最適內(nèi)參基因個數(shù)為2(圖6-B)；在花發(fā)育不同階段，V2/V3=0.126<0.15，說明采用2個內(nèi)參基因即可(圖6-C)。

圖6 geNorm分析確定候選內(nèi)參基因數(shù)目

2.3.2 NormFinder分析 NormFinder軟件通過方差分析對候選內(nèi)參基因進行篩選，利用ΔCt法計算候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定值(S)，從而對內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性進行評價，S值越小，基因越穩(wěn)定。NormFinder分析結(jié)果顯示，在有花組中，UPL7(S=0.172)和SAND(S=0.221)表達最穩(wěn)定，GAPDH(S=0.898)表達最不穩(wěn)定；在無花組中，UPL7(S=0.037)和GAPDH(S=0.072)表達最穩(wěn)定，Actin(S=0.201)表達最不穩(wěn)定；在花發(fā)育不同階段，Actin(S=0.036)、PEPKR1(S=0.077)和GAPDH(S=0.077)表達最穩(wěn)定，PP2A(S=0.350)表達最不穩(wěn)定；是否有花，對GAPDH的穩(wěn)定性排名有重要影響(表2)。

表2 NormFinder分析候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性排名

2.3.3 BestKeeper分析 BestKeeper通過計算不同樣品間候選內(nèi)參基因Ct值產(chǎn)生配對的變異系數(shù)(CV)、標準差(s)的大小來對各內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性進行評價。CV和s越小，說明該內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好；若s>1，則說明該內(nèi)參基因表達不穩(wěn)定。BestKeeper軟件分析結(jié)果顯示，在有花組中，Actin(s=0.42)和PEPKR1(s=0.78)s值小于1，說明這2個候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性較好；在無花組中，8個候選內(nèi)參基因的s值均小于1，說明各內(nèi)參基因的表達均為穩(wěn)定，穩(wěn)定性由高到低進行排序為：UPL7>SAND>GAPDH>PP2A>TIP41>EF1α>Actin>PEPKR1；在花發(fā)育不同階段中，8個內(nèi)參基因的s值均小于1，說明各基因的表達均為穩(wěn)定，穩(wěn)定性由高到低進行排序為：EF1α>Actin>PEPKR1>GAPDH>UPL7>TIP41>SAND>PP2A(表3)。

表3 BestKeeper分析候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性排名

2.3.4 RefFinder綜合排名分析 由于各個軟件算法原理不同，3個軟件獲得的最穩(wěn)定的內(nèi)參基因排名有差異，最后使用RefFinder對8個候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性進行綜合分析，幾何平均值越小，其表達穩(wěn)定性越好。結(jié)果顯示，在有花組中,8個候選內(nèi)參基因中表達的穩(wěn)定性由高到低依次為：SAND>UPL7>EF1α>PEPKR1>Actin>TIP41>PP2A>GAPDH；在無花組中,內(nèi)參基因的穩(wěn)定性由高到低依次為：UPL7>GAPDH>SAND>TIP41>EF1α>PP2A>PEPKR1>Actin；花發(fā)育不同階段中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性由高到低依次為：Actin>EF1α>PEPKR1>GAPDH>SAND>UPL7>TIP41>PP2A(表4)。

表4 候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性綜合排名

2.4 內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性驗證

為驗證篩選的內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性，分別用穩(wěn)定性排名最高的2個內(nèi)參基因Actin、EF1α及Actin+EF1α組合，以最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因PP2A為對照，對花發(fā)育不同階段的JsDXS和JsPAL2的表達水平進行分析。結(jié)果顯示，以穩(wěn)定性好的內(nèi)參基因Actin、EF1α及Actin+EF1α組合為參照時，JsDXS基因在花發(fā)育不同階段的表達水平的變化趨勢基本一致，而用最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因PP2A為參照時，花發(fā)育不同階段的表達水平的變化趨勢不一致(圖7-A)；同樣，以Actin、EF1α及Actin+EF1α組合為參照時，JsDXS在花發(fā)育不同階段的表達水平的變化趨勢基本一致，而用PP2A為參照時，花發(fā)育不同階段的表達水平的變化趨勢不一致(圖7-B)。

圖7 不同內(nèi)參基因或組合分析茉莉花花發(fā)育不同階段JsDXS和JsPAL2表達水平

3 討論與結(jié)論

qRT-PCR是目前在轉(zhuǎn)錄水平上研究基因表達最為普遍的技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強、快速高效和重復(fù)性好等優(yōu)點，常用于相對定量分析生物體不同組織間、不同生長發(fā)育時期、不同試驗條件下基因表達的變化，而qRT-PCR對目的基因進行表達水平分析的前提是選擇表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因[4, 24]。試驗中常選擇管家基因作為內(nèi)參基因，因為這些基因在生物體各組織和不同生長階段表達水平較為穩(wěn)定。近年來研究發(fā)現(xiàn)，這些管家基因在不同植物、組織、生長發(fā)育時期及環(huán)境下表達的水平并非穩(wěn)定[25]。如非生物脅迫處理的海濱雀稗草中，內(nèi)參基因U2AF和GAPDH在鎘處理的葉和冷處理的根中穩(wěn)定性最好，U2AF和FBOX在鎘處理的根和冷處理的葉中穩(wěn)定性最好，SAND和CACS在鹽處理的葉中穩(wěn)定性最好[4]；火龍果果實不同發(fā)育期樣本中，內(nèi)參基因YLS8和TBP2穩(wěn)定性最好[26]；在水稻稻瘟病菌的發(fā)病機理研究中，Edf和TI是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而常見的管家基因18SrRNA和UBQ5是最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因[27]。本研究也有類似發(fā)現(xiàn)，同一基因在不同組織中穩(wěn)定性存在較大差異，如GAPDH在不同組織(有花組)中是最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而在不同組織(無花組)中是穩(wěn)定的內(nèi)參基因。由此可見，不只在不同物種間內(nèi)參基因的表達存在差異，即便同一物種，若研究的組織、生長階段和環(huán)境等不同，內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性也存在差異。因此，做目的基因表達分析之前，必須對具體條件下內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性進行篩選及驗證。

geNorm、NormFinder和BestKeeper是目前對內(nèi)參基因穩(wěn)定性進行評價中最常用的3種軟件。本研究中，發(fā)現(xiàn)3種軟件的內(nèi)參基因穩(wěn)定性排名有所不同，其中，茉莉花不同組織(有花組)中，Actin在BestKeeper中的穩(wěn)定性最好，但是其在geNorm和NormFinder中的穩(wěn)定性都較差；SAND和UPL7在BestKeeper中的穩(wěn)定性不好，但其在geNorm和NormFinder中的穩(wěn)定性都較好。該現(xiàn)象在柑橘(Citrusreticulata)[28]、鳳丹[29]的內(nèi)參基因的篩選中也有報道，推測可能與計算機內(nèi)置統(tǒng)計學算法不同有關(guān)，geNorm和NormFinder都是利用各內(nèi)參基因Ct值換算成Q值進行分析，而BestKeeper直接用Ct值進行分析[30]。在實際選用內(nèi)參基因時，為避免因軟件分析差異帶來的誤差，通常利用幾何平均法對不同軟件得到的結(jié)果進行分析得出綜合排名，該排名在一定程度上可以說明各內(nèi)參基因的穩(wěn)定性趨勢[9]。本研究利用RefFinder對8個候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性進行綜合分析，從而篩選出了在不同樣品中表達最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。geNorm分析發(fā)現(xiàn)，在茉莉花不同組織(有花組)中，Vn/Vn+1值均大于0.15，在榛[31]、梨[32]內(nèi)參基因的篩選中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，這可能是由于試驗材料來自不同組織，跨度較大而導致變異系數(shù)均大于0.15。

在對目的基因表達水平進行分析時，不僅要求所用內(nèi)參基因表達穩(wěn)定，而且要求其表達量與目的基因的表達量相近[33]。本研究中，茉莉花不同組織(無花組)、花發(fā)育不同階段最優(yōu)內(nèi)參基因中，GAPDH、EF1α表達豐度高，適合作為分析較高表達豐度目的基因時的內(nèi)參；UPL7、Actin表達豐度低，適合作為分析較低表達豐度目的基因時的內(nèi)參。本研究發(fā)現(xiàn)茉莉花發(fā)育不同時期最適內(nèi)參基因為Actin和EF1α，這與已有研究中常用Actin作為內(nèi)參基因一致[15, 22, 34]，說明Actin基因適合做花的內(nèi)參基因。利用最適內(nèi)參基因Actin和EF1α對目的基因JsDXS和JsPAL2的表達水平進行分析，結(jié)果進一步說明篩選出來的Actin和EF1α穩(wěn)定性較好。

總之，本研究對茉莉花的內(nèi)參基因進行了篩選，不同組織(有花組)的最優(yōu)內(nèi)參基因為SAND和UPL7；不同組織(無花組)的最優(yōu)內(nèi)參基因為UPL7和GAPDH；花發(fā)育不同階段的最優(yōu)內(nèi)參基因為Actin和EF1α。本研究結(jié)果為茉莉花基因表達分析提供了可選擇的內(nèi)參基因，為后續(xù)基因表達、功能及調(diào)控等相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。