榮 恒,張夢瑤,賀建寧,柳 楠

(青島農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院,山東 青島 266109)

敖漢細毛羊是我國具有代表性的毛肉兼用細毛羊品種[1-2]。敖漢細毛羊是通過雜交培育得到的品種,它的父系和母系分別為前蘇聯(lián)美利奴羊和內(nèi)蒙古當?shù)氐拿晒叛騕3]。羊的毛囊能夠產(chǎn)生被毛,羊毛的產(chǎn)量也與毛囊息息相關(guān)[4]。因此,對于敖漢細毛羊來說,羊毛的品質(zhì)尤為重要?，F(xiàn)階段,它已有適應性強、體質(zhì)結(jié)實繁殖率高、體格大等優(yōu)勢[5],但還需要進一步提高凈毛產(chǎn)量,增加羊毛長度。因此,對于毛囊發(fā)育有關(guān)的基因的研究就很有必要。毛囊發(fā)育中起重要作用的有胰島素樣生長因子(IGF)家族、表皮生長因子(EGF)家族、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)以及成纖維細胞生長因子(FGF)家族等[6-7]。

BMPs正是TGF-β家族中的成員,隸屬于TGF-β超家族[8],是一種具有分泌功能的蛋白,其成員有很多種[9]。有研究表明,BMPs對毛囊生長發(fā)育的作用主要表現(xiàn)為抑制[10],其表達量在毛囊發(fā)育的退行期最高并隨著毛囊的周期性生長發(fā)育呈現(xiàn)出周期性變化[11]。而BMPRs可與BMPs發(fā)生拮抗作用,間接促進毛囊的生長。毛青青[12]通過對小鼠的研究結(jié)果表明，BMP6基因是影響皮膚和毛囊發(fā)育的一個關(guān)鍵性基因。BMPR1B屬于BMPs家族的Ⅰ型受體成員[13],它受到BMPs家族的控制,BMPs的表達同時依賴于BMPRs類受體。BMPs和BMPRs在毛囊的發(fā)育過程中均起到一定的作用,前人已經(jīng)對BMP6[14]和BMPR1B[15]的功能進行了研究,本研究在此基礎(chǔ)上,通過共轉(zhuǎn)染開展了兩基因相互作用研究,旨在為進一步的育種工作提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選取40日齡的健康胎羊并及時消毒處理。

TRIzol(Roche)試劑、蛋白裂解液、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶、KpnⅠ限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、pcDNA3.1質(zhì)粒、DH5α感受態(tài)細胞、DMEM(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、胰蛋白酶、標準胎牛血清、DPBS(磷酸緩沖鹽溶液)、Lipofectamine 2000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SoSo試劑盒、切膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、培養(yǎng)皿等均購自青島尚賽科貿(mào)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計在綿羊BMP6和BMPR1B基因序列(GenBank登錄號分別為XM_027958445.1和NM_001009431.1)CDS區(qū)外側(cè)設(shè)計引物并在上、下游引物的5′加入同源臂。BMP6基因完成后的引物序列:(F)5′-TTTAAACTTAAGCTTGGTACCATGATC CTGGTAACCGAATGCTG-3′;(R)5′-TGGATCCGAG CTCGGTACCTCAGCGGCACACATCCCTCCACTA-3′。BMPR1B基因完成后的引物序列:(F)5′-TTTAAAC TTAAGCTTGGTACCATGCTTTTGCGAAGTTCAGG-3′;(R)5′-TGGATCCGAGCTCGGTACCTCAGAGCTTAAT GCCTGGGACTCTGAC-3′。

PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳檢測,PCR體系(25 μL):DNA模板1 μL,上下游引物各1 μL,Green Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。

1.2.2 目的基因與表達載體同源重組 對表達載體pcDNA3.1進行EcoRⅠ單酶切,體系為:EcoRⅠ、KpnⅠ1 μL;pcDNA3.1 5 μL;Buffer 5 μL;ddH2O 39 μL。通過膠回收獲得較為純凈的目的基因以及pcDNA3.1,通過T4DNA連接酶將其連接。而后轉(zhuǎn)至DH5α感受態(tài)細胞后振蕩培養(yǎng),提取陽性質(zhì)粒。

1.2.3 成纖維細胞的培養(yǎng) 取40日齡胎羊組織置于培養(yǎng)皿中,用 75%的酒精清洗后再用含雙抗的PBS清洗。洗凈后將其剪成1.5 mm3左右,放入新皿中,加胎牛血清,置于培養(yǎng)箱CO2濃度5%、37 ℃條件下,4 h后加培養(yǎng)液。24 h后,用PBS沖洗后更換培養(yǎng)液,定時觀察。細胞生長到95%左右進行傳代培養(yǎng)。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染 傳代后稀釋pcDNA3.1-BMP6、pcDNA3.1-BMPR1B和脂質(zhì)體,需轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BMP6質(zhì)量為6 030.41 ng,pcDNA3.1-BMPR1B質(zhì)量為6 030.41 ng,培養(yǎng)液448.4 μL。脂質(zhì)體取20 μL用培養(yǎng)液稀釋到500 μL。對照組,取培養(yǎng)液500 μL,脂質(zhì)體取20 μL用培養(yǎng)液稀釋到500 μL。試驗組、對照組室溫各孵育10 min。將脂質(zhì)體和pcDNA3.1-BMP6、pcDNA3.1-BMPR1B兩者進行混勻,室溫孵育20 min。將混合物加入到培養(yǎng)皿中,緩慢加入4 mL培養(yǎng)液(培養(yǎng)液不含血清不含雙抗)。在培養(yǎng)箱CO2濃度5%、37 ℃條件下,培養(yǎng)6 h后換液,繼續(xù)培養(yǎng)36 h。

1.2.5 細胞轉(zhuǎn)染后的RT-PCR 擴大培養(yǎng)轉(zhuǎn)染成功的單細胞,之后用TRIzol(Roche)試劑對轉(zhuǎn)染后的細胞進行RNA的提取并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計BMP6、BMPR1B和GAPDH基因熒光定量PCR引物序列(表1)。

表1 qPCR引物信息

1.2.6 Western Blot 裂解并提取細胞中的蛋白質(zhì),電泳后對蛋白質(zhì)進行PVDF轉(zhuǎn)膜2 h后封閉蛋白質(zhì)2 h;TBST洗膜3次,每次5 min;稀釋一抗,用一抗孵育PVDF膜12 h;用TBST洗膜3次,每次5 min;稀釋二抗,孵育1.5 h;在暗室中曝光。條帶灰度值用Image J軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因擴增

圖1為PCR后凝膠電泳分析結(jié)果,擴增條帶單一明亮,大小分別位于537,1 509 bp處,與已知大小相符。

M.2000 Marker;1.BMP6基因擴增條帶(537 bp);2.BMPR1B基因擴增條帶(1 509 bp)。

2.2 pcDNA3.1載體單酶切及純化

酶切結(jié)果如圖2所示,pcDNA3.1載體為大小5 428 bp,圖中條帶與其大小所吻合,可用于后期的試驗。

M.10000 Marker;1.pcDNA3.1載體KpnⅠ單酶切;2.pcDNA3.1載體EcoRⅠ單酶切。

2.3 表達載體pcDNA3.1與目的片段重組及鑒定

菌液PCR電泳結(jié)果如圖3,擴增條帶單一明亮,位于537，1 509 bp處,分別為BMP6、BMPR1B基因。菌液測序后用Blast比對,經(jīng)測序比對后堿基均未發(fā)生突變。提取重組質(zhì)粒,如圖4所示,1，2為pcDNA3.1-BMP6重組質(zhì)粒,大小為5 965 bp;3，4為pcDNA3.1-BMPR1B,大小為6 937 bp,與圖中條帶相符,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。

M.2000 Marker;1,2.BMP6菌液PCR;3,4.BMP1B菌液PCR。

M.10000 Marker;1,2.pcDNA3.1-BMP6重組質(zhì)粒;3,4.pcDNA3.1-BMPR1B重組質(zhì)粒。

2.4 細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)24 h后逐漸貼壁,組織塊的四周逐漸有細胞游出。傳代培養(yǎng)在細胞密度約為95%時進行,采用胰蛋白酶消化法,2 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心處理分離,成纖維細胞,之后擴大培養(yǎng)。觀察結(jié)果如圖5,6所示。

圖5 成纖維細胞原代培養(yǎng)(×100)

圖6 成纖維細胞傳代培養(yǎng)(×100)

2.5 實時熒光定量PCR檢測mRNA的表達

對RT-PCR引物檢測結(jié)果如圖7所示,擴增條帶單一明亮,可進行后續(xù)RT-PCR。

M.500 Marker;1,2.GAPDH擴增條帶(A); M.500 Marker;1,2.BMP6擴增條帶;3,4.BMPR1B擴增條帶(B)。

圖8為實時熒光定量擴增曲線和溶解曲線,曲線清晰且峰值清晰單一,表明在實時熒光定量PCR過程中得到了特異性的擴增產(chǎn)物,可用來進行定量分析。經(jīng)共轉(zhuǎn)染后,BMPR1B基因的表達量極顯著提高(P<0.01),BMP6基因無明顯變化(圖9)。

圖8 熔解曲線峰值圖和擴增曲線圖

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01);相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖12同。

2.6 Western Blot檢測蛋白的表達

Western Blot結(jié)果如圖10,其灰度值用Image J軟件分析灰度值。由圖11可知,經(jīng)共轉(zhuǎn)染成纖維細胞后BMPR1B蛋白的表達極顯著高于單轉(zhuǎn)染組(P<0.01),BMP6蛋白的表達無明顯變化,與基因表達結(jié)果一致。

圖10 BMP6、BMPR1B蛋白條帶

圖11 BMP6、BMPR1B蛋白相對表達量

3 討論和結(jié)論

BMP6是BMP家族的一員[16]。文獻中已有相關(guān)研究,BMP家族在絨山羊毛囊發(fā)育的退行期表達量最高,在生長期其表達量會降低,隨著毛囊的周期性生長而呈現(xiàn)周期性變化[17],對毛囊的生長發(fā)育具一定的抑制作用。McMahon等[18]研究表明,Noggin基因?qū)γ业陌l(fā)育具有一定的促進作用,其作用機制是基于抑制BMP基因家族的活性。相關(guān)研究證實,在敲除小鼠BMP6基因的受體BMPR1A后,小鼠的毛囊形態(tài)發(fā)生了改變,嚴重的甚至導致光禿[19]。而BMPR1B基因也屬于BMP信號通路中的一員,因此推測BMP6與BMPR1B這2個基因間可能存在基因的相互作用。對BMPR1B基因的研究就目前來說主要集中在動物的生殖、繁殖等方向。尤其是在排卵過程中有著重要作用,過表達BMPR1B基因的美利奴羊?qū)β殉差w粒細胞分化、卵泡發(fā)育、排卵等有很大影響[20],大大提高了排卵率。但對于BMPR1B基因在細毛羊毛囊中的研究還比較罕見,并且關(guān)于BMP6基因與BMPR1B基因間的相互作用目前尚未發(fā)現(xiàn)報道。因此,本試驗通過對pcDNA3.1-BMP6和pcDNA3.1-BMPR1B載體的構(gòu)建并將其轉(zhuǎn)染至成纖維細胞,采用實時熒光定量PCR、Western Blot檢測其表達,研究兩基因間的相互作用,從細胞水平上驗證了兩基因間的互做以及對細毛羊毛囊的影響。

本研究通過對pcDNA3.1-BMP6、pcDNA3.1-BMPR1B的構(gòu)建,測定轉(zhuǎn)染成纖維細胞后mRNA及蛋白的表達量。結(jié)果表明,共轉(zhuǎn)染成纖維細胞后BMPR1B基因的表達量極顯著升高且共轉(zhuǎn)染組的表達量極顯著高于單轉(zhuǎn)染組(P<0.01),BMP6共轉(zhuǎn)染組與單轉(zhuǎn)染組表達量近乎相同。由此推斷,BMP6基因可能會促進BMPR1B基因的表達,而BMPR1B對BMP6基因的表達幾乎沒有影響?？蔀檫M一步的分子育種工作提供依據(jù)。