韓信嶸,吳慧光,2,吳江鴻,王國富,3,高樹新,3

(1.內蒙古民族大學 動物科技學院,內蒙古 通遼 028042; 2.揚州大學 獸醫(yī)學院,江蘇 揚州 225009;3.內蒙古民族大學 黃牛遺傳繁育研究所,內蒙古 通遼 028000)

中國是世界上第三大牛肉生產國和消費國,隨著人們的生活水平不斷提高,中國居民牛肉消費持續(xù)增加。牛肉品質的優(yōu)劣直接影響到適口性,為了迎合大眾口味,滿足大眾需求,提高牛肉品質是當前育種中亟待解決的問題,而研究脂肪沉積相關基因的功能和調控機制對改善肉質至關重要。安格斯牛和中國西門塔爾牛是具有不同脂肪沉積能力的2個品種,安格斯牛的背膘厚度顯著高于中國西門塔爾牛[1],剪切力顯著低于中國西門塔爾牛[2],肌內脂肪(Intramuscular fat, IMF)含量顯著高于中國西門塔爾牛[3]。中國西門塔爾牛于20世紀80年代引入中國,是乳、肉、役兼用的全能牛,經育種改良的中國西門塔爾牛是科爾沁主要肉牛品種,在我國東北部、南部以及西部地區(qū)均有分布。中國西門塔爾牛肌肉豐滿,生長速度較快,胴體肉多,脂肪少而分布均勻,屠宰率可達65%,相對于黃牛、荷斯坦牛和蒙古牛來說,西門塔爾牛在屠宰率、瘦肉率及肉用性能方面具有顯著的優(yōu)勢,但其肉質要稍遜色于世界上其他著名的肉牛品種[4]。安格斯牛是20世紀70年代引入中國,經長期育種后,分布在新疆、內蒙古、東北、山東等地,被毛的顏色主要為黑色,其次為黑棕色或紅色,身材矮小,耐寒能力、耐粗飼和抗病能力都很強。安格斯牛早熟、肉質質量好、凈肉率高、大理石花紋明顯,屠宰率達60%～65%,許多國家及地區(qū)常用安格斯牛作為母本對地方牛進行雜交來改良品種[5]。

脂肪沉積能力是牛肉品質的評價指標之一,影響脂肪沉積能力的因素有很多,如遺傳因素、生長環(huán)境和營養(yǎng)水平等,其中遺傳因素占據(jù)主導地位。目前發(fā)現(xiàn)參與脂肪代謝的分子主要有脂肪酸結合蛋白、脂肪酸合成酶、黑色素皮質素受體和脂聯(lián)素等。另外,許多激素和細胞因子也參與脂質代謝,如胰島素、糖皮質激素和成脂因子等,上述分子基因的多態(tài)性與脂肪沉積的相關性已經通過試驗得到了證實,但目前關于安格斯牛和中國西門塔爾牛脂肪沉積的關鍵基因及調節(jié)機制的研究報道卻很少。

為了研究與脂肪沉積相關的基因,本試驗以安格斯牛和中國西門塔爾牛作為研究對象,對其背膘組織進行轉錄組測序,通過GO富集和KEGG代謝通路的分析,結合Cytoscape等分析與脂肪沉積有關的基因,并對與脂肪沉積相關的3個基因DKKL1、ACACB和PTGS2進行了qRT-PCR的驗證,以期找出調控脂質代謝的候選基因,為中國西門塔爾牛和安格斯牛的后續(xù)選育提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

安格斯牛和中國西門塔爾牛都來自內蒙古通遼市余糧畜業(yè)育肥牛場,屠宰前牛場按照日糧標準進行集中統(tǒng)一飼喂,且都為閹牛,育肥期為60 d。肉牛樣本是在統(tǒng)一條件下進行采集,及時取樣,液氮保存。進行轉錄組測序的6頭牛是通過聚類分析挑選的,能夠很好地反映總體水平。

1.2 轉錄組測序及新轉錄本預測

TRIzol法提取RNA后用Nano-Drop2000測定RNA濃度。檢測合格后按照說明建庫后利用BGISEQ-500平臺對安格斯牛和中國西門塔爾牛背膘樣品的RNA測序并獲得轉錄組數(shù)據(jù)。使用SOAPnuke軟件對所得數(shù)據(jù)進行過濾,去除低質量reads以確保數(shù)據(jù)的準確性。

與參考基因組比對之后,先使用StringTie[6]對每個樣品進行轉錄本重構,再使用Cuffmerge(Cufflinks的工具之一)將所有樣品的重構信息整合在一起,最后使用Cuffcompare[7]將重構的轉錄本與參考注釋信息比較得到新轉錄本。使用CPC[8]對新轉錄本進行蛋白編碼潛力預測,最終將預測具有蛋白編碼潛力的新轉錄本加入到參考基因序列中,得到一個完整的參考序列信息,后續(xù)將基于此參考序列進行分析。

1.3 SNP、差異剪接基因的檢測

根據(jù)參考基因組比對結果,利用GATK[9]檢測每個樣品的SNP信息。通過比對基因組數(shù)據(jù)、標記重復序列、分割序列和重校準堿基對數(shù)據(jù)進行預處理。然后用HaplotypeCaller檢測SNP。使用rMATS[10]檢測不同樣品之間的差異剪接基因(DSG)和樣品自身的差異剪接基因,以FDR≤0.05為判斷標準,用DEGseq[11]法進行差異基因的檢測。并將P-values矯正為qvalues。為了提高DEGs的準確性,將差異倍數(shù)為2倍以上并且qvalue≤0.001的基因,篩選為顯著差異表達基因。

1.4 GO功能注釋和KEGG通路分析

對轉錄組數(shù)據(jù)中的差異表達基因進行GO(Gene Ontology)功能注釋和KEGG通路富集分析。過濾后的Clean reads保存為FASTQ格式根據(jù)差異基因檢測結果,對其GO功能進行分類以及富集分析。

根據(jù)GO注釋結果以及官方分類,將差異基因進行功能分類,同時使用R軟件中的phyper函數(shù)進行富集分析。然后對P-value進行FDR校正,通常FDR≤0.01的功能視為顯著富集。

生物體內的生物學行為是由多種蛋白相互協(xié)調的,Pathway分析是基于公共數(shù)據(jù)庫KEGG對生物學功能的進一步了解,可以初步了解蛋白質的功能,還有助于驗證和闡明蛋白質的生物調控機制[12]。KEGG提供了通過Pathway作圖過程將基因組與生命聯(lián)系起來的參考知識庫,可以將基因的基因組或轉錄組內容物映射到KEGG參考途徑以推斷細胞或生物體的系統(tǒng)行為[13]。KEGG資源提供了將基因組與生物系統(tǒng)連接起來的參考知識庫,分類為基因組空間(KEGG GENES)和化學空間(KEGG LIGAND)中的構建塊包括內源分子和外源分子,以及受體互作和反應網(wǎng)絡(Pathway)的接線圖以及計算機化的KeggBrite[12]。

1.5 熒光定量分析

熒光定量分析的主要目的是驗證轉錄組數(shù)據(jù)的差異表達基因,首先提取樣本總RNA并通過Nanodrop對RNA含量進行檢測,然后將RNA逆轉錄成cDNA并對其進行凝膠電泳檢測,配制25.0 μL的反應體系:SYBR 12.5 μL,上下游引物各0.5 μL,cDNA模板2.0 μL,去離子水9.5 μL;配好后將樣品加到96孔板中,然后以4 000 r/min的轉速離心30 s,最后放到已做好設定的熒光定量PCR儀中。qRT-PCR可以對差異表達基因的表達量進行分析。

2 結果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)分析

2.1.1 測序數(shù)據(jù)過濾 過濾后的reads質量統(tǒng)計結果見表1,通過BGISEQ-500平臺對來自中國西門塔爾和安格斯牛的背膘的6個樣品進行轉錄組測序,過濾前reads數(shù)為120.36 Mb。安格斯牛每個樣品平均產出10.95 Gb,中國西門塔爾牛平均產出10.96 Gb。過濾后reads占比在安格斯牛為90.98%,中國西門塔爾牛為91.05%。數(shù)據(jù)過濾后,Q20(質量大于20的堿基數(shù)目占總堿基數(shù)目的比例)安格斯牛為97.49%,中國西門塔爾牛為97.56%,都大于97.00%,Q30安格斯牛為90.22%,中國西門塔爾牛為90.36%,都大于90.00%,表明測序結果良好,符合建庫要求。

表1 過濾后的reads質量

2.1.2 參考基因組比對 reads對基因的比對率統(tǒng)計見表2,使用HISAT[14]將Clean reads與參考基因組序列比對,結果顯示，樣品比對基因組的總比對率安格斯牛為92.19%,中國西門塔爾牛為92.47%,比對基因集的唯一比對率為安格斯牛為70.56%,中國西門塔爾牛為71.47%。同時樣品間均勻的比對率表明，樣品之間的數(shù)據(jù)具有可比性。

表2 參考基因組比對結果

2.1.3 新轉錄本預測 與參考基因組比對之后,將轉錄本重構,與參考注釋信息比較得到新轉錄本。共計得到新轉錄本19 747個,其中預測的16 576個為編碼的轉錄本數(shù),15 643個屬于已知蛋白編碼基因新的可變剪接亞型,933個屬于新的蛋白編碼基因的轉錄本,剩下的3 171個屬于LncRNA。

2.2 SNP檢測結果

與參考基因組比對之后使用GATK檢測每個樣品的SNP[9],SNP統(tǒng)計類型見表3。安格斯牛的A-G和C-T變異的SNP數(shù)目158 116個,A-C、A-T、C-G 和 G-T 變異的SNP數(shù)目為60 349個,所有變異類型的總數(shù)目為218 465個。中國西門塔爾牛的A-G和C-T變異的SNP數(shù)目179 321個,A-C、A-T、C-G 和 G-T 變異的SNP數(shù)目為68 589個,所有變異類型的總數(shù)目為247 910個。安格斯牛的變異的SNP數(shù)目普遍低于中國西門塔爾牛。

表3 SNP類型統(tǒng)計

2.3 差異表達基因的篩選和功能注釋

根據(jù)各個樣品基因表達水平,檢測樣品之間的差異表達基因。中國西門塔爾牛對安格斯牛的差異表達基因的上下調關系見圖1,中國西門塔爾牛對安格斯牛差異基因表達的分析中有1 296個差異表達基因,其中上調基因802個(Fold change≥2,q≤0.001),下調基因494個(Fold change≤-2,q≤0.001),即中國西門塔爾牛上調表達基因數(shù)高于安格斯牛的上調表達基因數(shù)。

圖1 DEGs的Scatter-plot分布

根據(jù)差異基因檢測結果,對所得數(shù)據(jù)進行進一步的分類及富集分析,由圖2可看出,對篩選的6 244個基因進行GO功能分類注釋和富集,其中2 205個DEGs注釋到26個生物學進程(Biologicalprocess,BP)中,3 149個DEGs注釋到15個細胞組分(Celluar component, CC)中,890個DEGs注釋到12個分子功能(Molecular function, MF)中。進一步的分類和富集分析顯示富集比較靠前且超過300個DEGs,BP中的細胞進程398個,占比6.37%;單細胞進程369個,占比5.91%;CC中的細胞組分396個,占比6.34%;膜組分394個,占比6.31%;MF中的結合功能380個,占比6.09%。

圖2 差異基因GO功能分類

根據(jù)差異基因檢測結果,對其進行KEGG生物通路分類以及富集分析,結果見圖3,通過KEGG代謝通路分析牛背膘組織的Unigene參與了6大類共44小類的代謝通路,并且一共注釋到了2 158個基因。其中基因數(shù)量排名靠前的代謝通路主要包括人類疾病通路,注釋了616個基因,占比28.54%,有機系統(tǒng)注釋了586個基因,占比27.15%,然后依次為環(huán)境信息進程、新陳代謝通路、細胞進程以及遺傳信息進程,其依次占比為19.00%,12.00%,9.87%,3.43%。

圖3 差異基因Pathway分類

對差異表達基因的數(shù)據(jù)進行了Pathway富集,由圖4可知在cAMP信號通路、神經活性配體-受體互作以及細胞因子受體互作3個通路上基因的富集程度最高,即數(shù)量最多且富集結果顯著。

圖4 差異基因Pathway富集分析

2.4 差異表達基因DKKL1、ACACB及PTGS2的熒光定量驗證

圖5為脂肪相關基因DKKL1、ACACB及PTGS2在轉錄組數(shù)據(jù)中表達量與qRT-PCR相對表達量的對比。熒光定量結果DKKL1、ACACB在中國西門塔爾牛的背膘中的相對表達量高于安格斯牛的背膘中的相對表達量(2-(ΔΔCt)>1),PTGS2在安格斯牛背膘中相對表達量高(2-(ΔΔCt)<1),差異表達模式均與RNA-seq表達模式一致,表明轉錄組數(shù)據(jù)可靠。可見DKKL1和ACACB在中國西門塔爾牛中表達量較高,PTGS2在安格斯牛體內表達較高。

圖5 DKKL1、ACACB及PTGS2的qRT-PCR中相對表達量(A)及RNA-seq表達量(B)

3 討論與結論

在初期屠宰試驗中得到中國西門塔爾牛剪切力顯著高于安格斯牛,且安格斯牛背膘脂肪厚度顯著高于中國西門塔爾牛(P<0.01)[1]。IMF含量與剪切力呈負相關,與嫩度呈正相關[15]。2個品種牛在脂肪沉積上有顯著差異,故候選基因的篩選具有一定的意義。

本研究通過BGISE-500對被背膘組織進行轉錄組測序,并對測序數(shù)據(jù)進行富集和注釋,從中找到與脂肪沉積相關功能和通路。從圖 4中可以看出注釋到cAMP信號通路中的差異基因數(shù)目最多且富集結果較為顯著。同時cAMP能促進動物機體內脂肪的分解代謝[16],但可降低肉中硬脂酸含量,增加不飽和脂肪酸含量,增加犢牛肉中脂肪含量[17]。線粒體內由二氧化碳/碳酸氫鹽調節(jié)的可溶性cAMP激活蛋白激酶A(PKA)使線粒體蛋白磷酸化從而調節(jié)ATP的產生[18]。cAMP增加會激活cAMP依賴蛋白激酶,使激素敏感脂酶(HSL)磷酸化進而催化甘油三酯水解為甘油和脂肪酸[19]。轉變成酰基CoA,而后進入β-氧化和三羧酸循環(huán)(TCA)氧化產熱,游離脂肪酸(FFA)可使線粒體進入解偶聯(lián)狀態(tài),底物氧化耗能增強,最終導致脂肪分解加強[20]。

依據(jù)|log2(Fold chage)|≥1,q≤0.001對脂肪沉積表達差異基因進行篩選,初步篩選出3種基因DKKL1、ACACB及PTGS2。DKKL1(Dickkopf like acrosomal protein 1,Soggy)阻黑體,類似頂體蛋白1抑制物,位于牛的18號染色體,有7個外顯子,長度為985 bp,編碼233個氨基酸,屬于分泌性蛋白,是Wnt抑制劑小蛋白家族Dickkopf的成員。DKKs編碼的分泌蛋白通常通過阻止配體-受體相互作用[21]或抑制Wnt輔助受體LRP5/6來拮抗Wnt/β-catenin信號轉導,可局部地抑制Wnt調節(jié)的過程而達到促進脂肪沉積的功能。Mao等[22]的研究認為DKK1通過Krm蛋白的降解,破壞Wnt蛋白配體與Fz-LRP6形成的受體復合物,從而抑制Wnt信號通路。研究顯示DKK1、DKK2、DKK3及DKK4都可以抑制Wnt通路的傳導,促進脂肪沉積。DKKL1雖是Wnt家族的一員,但與DKK1,DKK2和DKK4不同[23],盡管與DKK3擁有相同的Sgy結構域,但是卻沒有2個富含Cys的LRP相互作用結構域[24],同時也有研究表明,非特異性通路中,Wnt只與Fz作用,而不需要LRP5/6。Dakhova等[24]研究顯示DKKL1可以通過負調節(jié)類固醇生成酶來調控睪酮的生成。睪酮可以降低膽固醇和體脂,但公閹牛體內的睪酮含量低于公牛,其作用機制和調節(jié)水平還有待進一步確定。因此，差異表達基因DKKL1對脂肪沉積的作用及在2個品種牛中的表達機制還需要后續(xù)試驗的驗證。

ACACB(Acetyl-CoA carboxylase beta,ACC2)乙酰輔酶A羧化酶β基因,位于牛的17號染色體,有56個外顯子,全長8 924 bp,共編碼2 431個氨基酸。ACC包含2種,ACC1和ACC2,其中ACC1位于胞質,主要參與脂肪的從頭合成,ACC2主要存在于線粒體外膜,主要作用于脂肪酸的氧化。它們具有70%相同的酶活性和同源性。在AMPK信號通路當中,AMPK會抑制ACACA和ACACB的活性,而它們的作用是催化乙酰輔酶A(CoA)羧化為丙二酰輔酶A,丙二酰輔酶A通過抑制肉毒堿棕櫚?；D移酶1(CPT1)而抑制脂酰肉堿向線粒體內的轉運從而導致游離脂肪酸增加[25],其中丙二酰輔酶A通常由線粒體外膜中的ACC2產生[26]。ACC2位于線粒體外膜,主要參與脂肪酸細胞氧化。在不同種屬中脂肪酸調節(jié)也有差異,ACC2含量也不同。Oh等[26]認為ACC2將成為治療肥胖和相關代謝疾病(如高脂血癥、胰島素抵抗和糖尿病)的靶基因。敲除ACACB會導致因為ACACB產生的Malonyl-COA水平的降低,進而導致脂肪酸降低,脂肪含量降低[27]。高麗南等[28]研究顯示，不同飼料營養(yǎng)以及不同品種肉牛中AMPK的含量不同,其中，中國西門塔爾牛的AMPK含量較高。AMPK脂肪酸氧化中起著重要作用,即將脂肪分解為游離的脂肪酸。在肌肉中脂肪酸氧化的提高與明顯降低的丙二酸單酰輔酶A水平有關,ACC2調控脂肪酸氧化,在肝臟中丙二酸單酰輔酶A水平就沒有變化,這表明ACC2必須在一個沒有ACC1產生的丙二酸單酰輔酶A的區(qū)域才能發(fā)揮作用。ACACB的作用機制和調節(jié)水平還有待進一步確定,差異表達基因ACACB對脂肪沉積的作用及在2個品種牛中的表達機制還需要后續(xù)試驗的驗證。

PTGS2(Prostaglandin-endoperoxide synthase 2,COX2)前列腺素內過氧化物合酶2,也稱環(huán)氧化酶-2。位于牛的16號染色體,含有10個外顯子,全長3 489 bp,共編碼604個氨基酸。COX2是一種催化花生四烯酸轉變成前列腺素前體(PGH2)的限速酶,是線粒體編碼蛋白,也是生物活性脂類調節(jié)物[29]。在脂肪細胞分解調節(jié)通路(Regulation of lipolysis in adipocytes)中COX2會間接促進前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)的表達,PGE2在前列腺受體EP3的作用下會促進抑制性蛋白(Gi)的表達,從而抑制腺苷酸環(huán)化酶(Adenylatecyclase,AC)的表達,從而導致cAMP信號通路激活受阻,最終促進脂肪沉積。PTGS2的表達以體質量指數(shù)依賴的方式增加,并且與肥胖程度密切相關。COX2在成熟脂肪細胞中的表達受到被噻唑烷二酮特異性靶向的PPARγ2的影響而減少[30]。PPARγ可改善皮下脂肪細胞的形態(tài),并降低了促炎蛋白COX2的表達[31]。Belda等[32]在研究10e12z-cla對3t3-l1細胞分化和完全分化的影響。10e12z-cla在整個分化期都能降低3t3-l1脂肪細胞分化的程度。這些變化僅在分化過程的中途才變得明顯,并伴隨著COX2表達的增加而發(fā)生,COX2表達是NF-κB活性的標志。10e12z-cla異構體抑制脂肪分化并誘導人脂肪細胞中的NF-κB轉錄激活。在體外完全分化的人脂肪細胞中,10e12z-cla也能誘導環(huán)氧合酶-2[32]。10e12z-cla在3t3-l1前脂肪細胞分化過程中顯著抑制脂肪細胞表型并誘導炎癥標志物COX2的表達[33]。但Yang等[34]在糖皮質激素相關的脂肪細胞分化的研究中發(fā)現(xiàn)E4bp4E4(啟動子結合蛋白4)能夠通過反式抑制PTGS2而促進脂肪沉積,而Fain等[35]的研究顯示，COX2與抗脂肪性前列腺素的生成具有功能耦合。該原因可能是COX2與抗脂肪性前列腺素的生成具有功能耦合,另一方面,在分化期24 h后,AA的補充導致了COX2轉錄水平的顯著降低,也可能是與脂肪細胞的功能調節(jié)有關。因此,PTGS2作為脂肪沉積的候選基因但還需更多試驗的驗證。

綜上,可初步確定DKKL1、ACACB及PTGS2為脂肪沉積的候選基因,對安格斯牛和中國西門塔爾牛脂肪沉積的后續(xù)研究和肉牛育種工作具有一定的積累意義和參考價值。