張瑞國(guó),李少斌,王繼卿,劉 秀,羅玉柱

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730070)

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast growth factors, FGFs)是20世紀(jì)在大腦及垂體的組織提取物中發(fā)現(xiàn)的一種能促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的活性物質(zhì)[1],具有多種功能的信號(hào)蛋白,在生長(zhǎng)發(fā)育、組織修復(fù)、脂肪代謝和器官形成中起著重要作用[2]。FGF18基因是FGF基因家族的一員,其編碼的蛋白質(zhì)屬于分泌蛋白,在山羊上被定位于20號(hào)染色體,全長(zhǎng)35 978 bp,含有5個(gè)外顯子,編碼207個(gè)氨基酸。FGF18通過與FGFs受體結(jié)合來進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo),其功能的發(fā)揮依賴于FGFs受體的時(shí)空表達(dá)[3]。

FGF18在骨的形成中起著關(guān)鍵作用[4],在這方面的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)。進(jìn)一步研究表明,FGF18在毛囊的發(fā)育和生長(zhǎng)周期也起著重要的調(diào)控作用。吳瑜瑜[5]研究發(fā)現(xiàn),在甘肅超細(xì)毛羊胎齡第87～108天,FGF18相對(duì)表達(dá)量逐漸升高,推測(cè)其在胎兒皮膚形成和發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用。在成年綿羊毛囊的生長(zhǎng)旺盛期和緩慢期之間、頸部和腹部之間的FGF18基因表達(dá)量存在差異[6]。FGF18基因在小鼠角蛋白5-陽性角蛋白細(xì)胞中被有條件地敲除時(shí),毛囊的靜止期會(huì)變得非常短,從而使毛囊生長(zhǎng)周期明顯縮短,表明FGF18是調(diào)節(jié)毛囊靜止期的關(guān)鍵信號(hào)[7]。曹校瑞等[8]研究表明,FGF18信號(hào)可以促進(jìn)小鼠毛囊從靜止期進(jìn)入再生長(zhǎng)期。

目前,有關(guān)FGF18基因多態(tài)性研究報(bào)道較少,并且集中在人類上。已有的研究表明,FGF18基因的遺傳多態(tài)性與中國(guó)漢族膝骨關(guān)節(jié)炎[9]和人類的非綜合征性唇腭裂[10]顯著相關(guān),但其多態(tài)性對(duì)毛發(fā)影響方面的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。毛發(fā)是毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的產(chǎn)物,凡影響毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的信號(hào)通路或基因都能間接地影響毛發(fā)的結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)[11]。鑒于FGF18基因?qū)γ疑L(zhǎng)發(fā)育有重要影響,并且在山羊上尚未有FGF18基因多態(tài)性的研究報(bào)道,探討其變異及其對(duì)羊絨性狀的影響具有重要意義。研究結(jié)果將為豐富山羊基因組研究及其遺傳改良提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 血樣的采集

采集453只山羊血樣,其中隴東絨山羊(甘肅環(huán)縣)293只,柴達(dá)木絨山羊(青海漠河清牧場(chǎng))110只,中衛(wèi)山羊(甘肅景泰)50只。頸靜脈采血,肝素鈉(Heparin sodium)抗凝、-70 ℃保存。

1.2 羊絨性狀數(shù)據(jù)的測(cè)定

收集12月齡隴東絨山羊羊絨樣品,并收集記錄耳號(hào)、性別、胎次和父系等信息。抓絨后對(duì)羊絨進(jìn)行稱質(zhì)量得到產(chǎn)絨量;在山羊的體側(cè)部測(cè)量絨層高度;采用投影顯微鏡法,用CU纖維細(xì)度儀測(cè)定絨纖維直徑,測(cè)定工作在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院生產(chǎn)與管理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 DNA的提取

采用北京全式金的EasyPure?Blood Genomic DNA Kit試劑盒,按照其說明書提取山羊血液全基因組DNA。

1.4 引物的設(shè)計(jì)

參照GenBank中山羊FGF18基因組的序列(序列號(hào)NC_030827),應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)3對(duì)引物分別擴(kuò)增FGF18基因第3，4，5外顯子(表1),引物由華大基因公司合成。

表1 FGF18基因各個(gè)外顯子的引物序列

1.5 PCR擴(kuò)增條件的建立

PCR反應(yīng)總體積20 μL,上、下游引物(0.25 μmol/L)各0.8 μL,TaqDNA預(yù)混酶(南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司)10 μL,dNTP 0.8 μL,ddH2O 7.6 μL。

PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s,按各引物退火溫度退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 SSCP檢測(cè)與測(cè)序

取2 μL的PCR產(chǎn)物,加入8 μL變性上樣緩沖液(98%去離子甲酰胺,10 mmol/L EDTA,0.025%溴酚藍(lán)和0.025%二甲苯氰),105 ℃變性5 min后,立即置于冰水混合物中,上樣于14%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis=37.5∶1),在230 V,15 ℃,0.5×TBE的條件下電泳18 h。電泳結(jié)束后,將非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行銀染顯色[12],然后置于A4紙上判型。將初步判定為純合子樣品的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序,序列測(cè)定由上海生工生物有限公司完成。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

用MEGA 5進(jìn)行序列比對(duì),利用 Popgen 32.0軟件計(jì)算有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles, Ne)、遺傳雜合度(Heterozygosity, He)、遺傳純合度(Homozygosity, Ho)和等位基因頻率。采用 PIC 0.6 軟件計(jì)算群體多態(tài)信息含量(Polymorphism information content, PIC)。應(yīng)用SPSS 19.0一般線性混合模型分析基因型對(duì)隴東絨山羊羊絨性狀的影響。研究發(fā)現(xiàn),父系對(duì)所有羊絨性狀均有影響(P<0.05),所以作為隨機(jī)因素納入模型。性別對(duì)羊絨性狀有影響(P<0.05)或潛在影響(P<0.20),所以作為固定因素納入模型。分析模型如下:

Yijk=μ+Gi+Fj+Sk+eijk

式中,Yijk為個(gè)體性狀表型值,μ為群體均值,Gi為基因型效應(yīng),Fj為父系隨機(jī)效應(yīng),Sk為性別效應(yīng),eijk為隨機(jī)誤差,下標(biāo)i,j和k為個(gè)體序號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的驗(yàn)證

山羊FGF18基因各擴(kuò)增區(qū)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。引物P1、P2和P3的目的片段分別為267,177,345 bp,擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段大小一致,且特異性較好,可做后續(xù)分析。

2.2 SSCP檢測(cè)與測(cè)序

山羊FGF18基因不同外顯子擴(kuò)增區(qū)的SSCP檢測(cè)結(jié)果顯示,只在Exon 5區(qū)檢測(cè)到3種帶型,而在其Exon 3和Exon 4區(qū)只檢測(cè)到1種帶型(圖2),表明Exon 3和Exon 4區(qū)無多態(tài)性。在山羊FGF18的Exon 5區(qū)檢測(cè)到的3種帶型,對(duì)應(yīng)3種基因型EE、FF和EF,由E和F 2個(gè)等位基因構(gòu)成。

圖2 山羊FGF18 SSCP檢測(cè)

山羊FGF18基因的Exon 5區(qū)各基因型測(cè)序峰圖和等位基因的序列比對(duì)結(jié)果見圖3,4。結(jié)果顯示,在山羊FGF18基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)的498處堿基發(fā)生T→C的突變(c.498T>C)。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),該突變位點(diǎn)沒有引起氨基酸種類的變化,屬于同義突變。

標(biāo)有方框的區(qū)域表示核苷酸序列突變的區(qū)域。

2.3 遺傳學(xué)分析

山羊FGF18基因 Exon 5的基因型頻率和等位基因頻率見表2。在3個(gè)山羊群體中,等位基因E均為優(yōu)勢(shì)等位基因?；蛐驮?個(gè)群體中的分布略有差異,隴東絨山羊、柴達(dá)木絨山羊和中衛(wèi)山羊的優(yōu)勢(shì)基因型分別是EF(46.42%)、EE(54.50%)和EF(48.00%)。

標(biāo)有下劃線處表示引物序列。

表2 FGF18基因Exon 5在3個(gè)山羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率

隴東絨山羊、柴達(dá)木絨山羊和中衛(wèi)山羊的FGF18基因的純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)等遺傳參數(shù)見表3。隴東絨山羊、柴達(dá)木絨山羊和中衛(wèi)山羊的FGF18基因Exon 5區(qū)的PIC值都處于0.25～0.50,均表現(xiàn)為中度多態(tài)。經(jīng)Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn),FGF18基因Exon 5區(qū)在3個(gè)山羊群體中都處于Hardy-Weinberg 平衡(P> 0.05),說明FGF18基因Exon 5區(qū)在這3個(gè)山羊群體中都達(dá)到了遺傳平衡。

表3 FGF18基因在3個(gè)山羊品種中的遺傳多態(tài)參數(shù)和Hardy-Weinberg 平衡檢測(cè)

2.4 山羊FGF18不同基因型對(duì)隴東絨山羊羊絨性狀的影響

從表4可知,FF型山羊的產(chǎn)絨量和絨層高度顯著高于EE型和EF型山羊(P<0.05),EE型和EF型山羊的產(chǎn)絨量和絨層高度沒有顯著差異(P>0.05)。各基因型山羊的羊絨纖維直徑?jīng)]有顯著差異(P>0.05)。

表4 山羊FGF18基因的不同基因型對(duì)隴東絨山羊羊絨性狀的影響

3 討論與結(jié)論

FGFs家族關(guān)于毛發(fā)方面的研究越來越被重視,已經(jīng)有許多成員被發(fā)現(xiàn)與毛發(fā)的生長(zhǎng)有關(guān),如FGF1、FGF2、FGF5、FGF7、FGF18、FGF20、FGF22等FGFs家族成員均被發(fā)現(xiàn)在皮膚和毛囊細(xì)胞中表達(dá),參與皮膚再生和毛發(fā)生長(zhǎng)的過程[13]。研究該家族成員在山羊中的表達(dá)調(diào)控、遺傳變異等分子生物學(xué)內(nèi)容,具有重要的理論和實(shí)踐意義。

本研究首次研究了山羊FGF18基因第3，4，5外顯子的突變情況,結(jié)果顯示,在山羊3個(gè)擴(kuò)增區(qū)域僅檢測(cè)到一個(gè)突變位點(diǎn)c.498T>C,表明該基因在這3個(gè)山羊品種中比較保守。有研究表明，F(xiàn)GF18的基因在進(jìn)化過程中高度保守[14-15],核苷酸的變異程度較低,這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。FGF18基因的保守可能與其功能有關(guān),它參與了一系列重要的生命活動(dòng)過程,如腦的發(fā)育、腺垂體的分化和增殖、骨骼生長(zhǎng)發(fā)育和胚胎發(fā)育等[16]。本研究結(jié)果表明,FGF18基因c.498T>C位點(diǎn)在隴東絨山羊、柴達(dá)木絨山羊和中衛(wèi)山羊中都符合Hardy-Weinberg平衡,說明經(jīng)過了選擇和進(jìn)化,該位點(diǎn)在3個(gè)群體中都達(dá)到了遺傳平衡。c.498T>C位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的3種基因型在這3個(gè)山羊品種的分布存在差異,造成這種差異的原因有很多,比如其選育史、生活環(huán)境和品種特性等。本研究發(fā)現(xiàn),FGF18基因的變異能同時(shí)對(duì)產(chǎn)絨量和絨層高度產(chǎn)生顯著影響,這與絨層高度和產(chǎn)絨量之間表型相關(guān)[17]相一致,2個(gè)性狀的表型相關(guān)系數(shù)是0.490(0.3<|r| ≤ 0.7),呈中度的正相關(guān)[17],推測(cè)其變異可能通過影響其中一個(gè)性狀而對(duì)另一個(gè)性狀產(chǎn)生間接影響。目前,關(guān)于FGF18基因變異對(duì)毛絨性狀的研究未見報(bào)道,但有研究表明,FGF18基因能通過影響毛囊的周期來調(diào)節(jié)毛發(fā)的生長(zhǎng)[8,13]。毛囊周期大致分為3個(gè)階段,生長(zhǎng)期、退化期和靜止期[18],毛囊周期的變化會(huì)影響毛發(fā)的生長(zhǎng)。Kawano等[13]把FGF18蛋白皮下注射到5只毛囊處于靜止期的小鼠中,發(fā)現(xiàn)有4只小鼠的毛囊開始生長(zhǎng),說明FGF18能促進(jìn)毛囊從靜止期向再生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)變。Vandenabeele等[19]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF18蛋白的表達(dá)量在患有季節(jié)周期性側(cè)面脫發(fā)的狗和正常狗中差異顯著,表明FGF18基因與毛發(fā)的生長(zhǎng)相關(guān)。以上研究都說明FGF18基因?qū)γl(fā)的生長(zhǎng)起到重要的調(diào)控作用,提示其變異能對(duì)毛絨的性狀產(chǎn)生一定影響。

雖然本研究在山羊FGF18外顯子中發(fā)現(xiàn)的c.498T>C位點(diǎn)是同義突變,沒有引起氨基酸的變化,但也可能對(duì)基因的功能產(chǎn)生影響。大量的研究結(jié)果表明,同義突變會(huì)從許多方面(基因剪接、mRNA穩(wěn)定性、折疊和翻譯、蛋白質(zhì)折疊和基于miRNA的表達(dá)調(diào)控等)影響基因的功能,與各種疾病存在一定的聯(lián)系[20]。FGF18對(duì)羊絨性狀的影響也可能是與FGF10等附近基因連鎖造成的。山羊的FGF10和FGF18基因都位于同一條染色體上,并且FGF10基因也能調(diào)控毛囊的周期[21]。

絨山羊產(chǎn)絨量、絨纖維直徑、絨層高度是衡量生產(chǎn)性能的3個(gè)重要指標(biāo)。育種中,在絨纖維直徑保持不變的情況下,提高產(chǎn)絨量、增加絨層高度是十分必要的。產(chǎn)絨量是衡量山羊經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要指標(biāo),在絨山羊的鑒定和選種中起到指導(dǎo)作用。絨層高度也是山羊重要的經(jīng)濟(jì)性狀,與產(chǎn)絨量聯(lián)系緊密。在絨山羊生產(chǎn)中,產(chǎn)絨量和絨層高度提高是符合生產(chǎn)需求的。FF型山羊的產(chǎn)絨量和絨層高度均高于其他基因型山羊,提示若以這2個(gè)性狀為選育目標(biāo),應(yīng)該提高群體中FF型山羊的比例。在3個(gè)山羊群體中,FF型山羊的比例均是最低的,說明山羊FGF18基因c.498T>C變異位點(diǎn)受人工選育的程度較低。

本研究在隴東絨山羊、柴達(dá)木絨山羊和中衛(wèi)山羊的第3，4，5外顯子只檢測(cè)到了一個(gè)突變位點(diǎn)c.498T>C,該位點(diǎn)在這3個(gè)山羊群體中均呈中度多態(tài),并且都符合Hardy-Weinberg平衡。在隴東絨山羊中,c.498T>C位點(diǎn)對(duì)產(chǎn)絨量和絨層高度影響顯著,提示若以這2個(gè)性狀為選育目標(biāo),FGF18基因可以作為分子改良的候選基因。