蘇碧儀 周德旺 馬品云 關(guān)平 譚耀駒

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病之一，耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的出現(xiàn)使結(jié)核病的防控形勢更加嚴(yán)峻。MDR-TB全球分布不均，印度和中國是全球MDR-TB疫情最嚴(yán)重的國家，每年新發(fā)MDR-TB患者數(shù)占全世界的50%以上，并且有不斷上升的趨勢[1]。快速診斷和治療MDR-TB，對(duì)結(jié)核病防控很有意義。BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“MGIT 960藥敏試驗(yàn)”)需要2～4周，往往延誤了耐藥結(jié)核病患者的診治。隨著結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制的研究，通過檢測耐藥相關(guān)基因突變的快速分子生物學(xué)檢測方法日益受到重視[2-4]。耐藥基因檢測法可以及時(shí)診斷耐藥肺結(jié)核，及早治療，防止耐藥結(jié)核病的傳播。本研究用熒光聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)探針熔解曲線法(簡稱“熔解曲線法”)檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群對(duì)利福平和異煙肼的耐藥基因突變，并與MGIT 960藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)其快速診斷利福平和異煙肼耐藥性的檢測效能及臨床意義。

資料和方法

一、 樣本和試劑

1.樣本來源：收集2018年1—12月廣州市胸科醫(yī)院收治的832例涂陽肺結(jié)核患者痰標(biāo)本。

2.主要試劑：(1)MGIT 960培養(yǎng)管，營養(yǎng)添加劑(OADC)，雜菌抑菌劑(PANTA)均購自美國BD公司；(2)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基因突變檢測試劑盒和結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變檢測試劑盒均購自廈門致善生物科技有限公司；(3)磁珠法核酸提取試劑由廈門致善生物科技有限公司生產(chǎn)。

3.主要儀器：(1)BACTECTMMGITTM960系統(tǒng)購自美國BD公司；(2)全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)(型號(hào)：SLAN-96P) 由上海宏石醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)；(3)Lab-Aid 824核酸提取儀由廈門百維信生物科技有限公司生產(chǎn)。

二、 實(shí)驗(yàn)方法

1. 本研究收集832例涂陽肺結(jié)核患者痰標(biāo)本進(jìn)行MGIT 960液體培養(yǎng)，結(jié)果顯示陰性52例(6.3%)，污染35例(4.2%)，陽性745例(89.5%)。對(duì)745份陽性培養(yǎng)物進(jìn)行菌種鑒定(生物芯片法)，其中，678份(91.0%)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，60份(8.0%)為非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)，7份(1.0%)為混合感染。對(duì)678例患者的痰標(biāo)本進(jìn)行MGIT 960藥敏試驗(yàn)和熔解曲線法耐藥基因檢測?；颊邩?biāo)本檢測流程見圖1。

圖1 患者標(biāo)本檢測流程圖

2. MGIT 960液體培養(yǎng)：按照操作規(guī)程，OADC和PANTA 1∶1混合后(臨時(shí)配制)，每支MGIT 960培養(yǎng)管加入800 μl含PANTA的OADC備用，將832份涂陽痰標(biāo)本進(jìn)行液化處理：取3 ml痰標(biāo)本置于50 ml 離心管內(nèi)，加入2倍痰標(biāo)本體積消化液(4%氫氧化鈉溶液與2.9%枸櫞酸鈉溶液1∶1混合)，振蕩20 s，靜置15 min，再加入磷酸鹽緩沖液(pH值6.8)至45 ml， 3000×g離心15 min，棄去上清液，加入1 ml緩沖液，混勻備用，取500 μl液化后痰標(biāo)本加入到上述MGIT 960培養(yǎng)管中，于BACTECTMMGITTM960系統(tǒng)中培養(yǎng)。剩余液化后痰標(biāo)本收集在2 ml離心管中，用于熔解曲線法的檢測。

3.MGIT 960藥敏試驗(yàn)：將832份涂陽痰標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)， BACTECTMMGITTM960儀器報(bào)告陽性的標(biāo)本先進(jìn)行抗酸涂片，驗(yàn)證MGIT 960培養(yǎng)管內(nèi)的培養(yǎng)物是否為抗酸桿菌。如果是抗酸桿菌，則采用基因芯片法進(jìn)行菌種鑒定，確定678份陽性培養(yǎng)物為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，再對(duì)其進(jìn)行利福平和異煙肼耐藥性檢測。

4. 熔解曲線法：經(jīng)液體培養(yǎng)、菌種鑒定后，得到678份鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的陽性培養(yǎng)物，將678份鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的陽性培養(yǎng)物對(duì)應(yīng)的痰標(biāo)本進(jìn)行熔解曲線法檢測。按照熔解曲線試劑盒說明書操作。結(jié)果顯示利福平耐藥性檢測結(jié)果無效(無法判斷是否耐藥)31例，異煙肼耐藥性檢測結(jié)果無效34例，剩余639例利福平和異煙肼同時(shí)檢測結(jié)果有效。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以 MGIT 960藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)熔解曲線法檢測利福平和異煙肼耐藥性的效能。Kappa值≥0.75表示二者之間一致性非常好，Kappa值0.4～0.75表示二者一致性較好，Kappa值≤0.4表示二者一致性較差。

結(jié) 果

639例患者的痰標(biāo)本同時(shí)獲得MIGT 960液體藥敏試驗(yàn)和熔解曲線法對(duì)利福平和異煙肼耐藥性檢測結(jié)果。

MGIT 960藥敏試驗(yàn)檢測對(duì)利福平的耐藥率為21.1%(135/639)，對(duì)異煙肼的耐藥率為29.6%(189/639)；熔解曲線法檢測對(duì)利福平的耐藥率為22.1%(141/639)，對(duì)異煙肼的耐藥率為26.0%(166/639)。

以MGIT 960藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)， 639例患者痰標(biāo)本熔解曲線法對(duì)利福平耐藥性檢測結(jié)果有615例與MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果一致，符合率為96.2%，敏感度和特異度分別為93.3%(126/135)和97.0%(489/504)，Kappa值為 0.89，一致性非常好；639例患者痰標(biāo)本熔解曲線法對(duì)異煙肼耐藥性檢測結(jié)果有598例與MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果一致，符合率為93.6%(598/639)，敏感度和特異度分別為83.1%(157/189)和98.0%(441/450)，Kappa值為0.84，一致性非常好(表1)。

討 論

近年來，MDR-TB已成為我國結(jié)核病防控領(lǐng)域的主要難題，早期檢測結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性不僅可以提高患者治愈率，同時(shí)也可以阻斷耐藥結(jié)核病在人群中的傳播，對(duì)耐藥結(jié)核病的防治具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，熔解曲線法檢測利福平耐藥結(jié)果無效31例，檢測異煙肼耐藥結(jié)果無效34例，對(duì)上述檢測標(biāo)本的陽性級(jí)別進(jìn)行核對(duì)，筆者發(fā)現(xiàn)大部分樣本為低陽性級(jí)別標(biāo)本(涂片結(jié)果為實(shí)際條數(shù)或者“+”)。有研究表明，熔解曲線法的檢測下限為100 菌落形成單位(CFU)/ml[5]。因此，標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌含量較低可能造成核酸擴(kuò)增及檢測失敗。

本研究結(jié)果表明，熔解曲線法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性檢測具有較高效能，其對(duì)利福平耐藥性檢測的敏感度(93.3%)與線性探針(94.3%)[6]持平并高于基因芯片(84.4%)[7]。這主要得益于熔解曲線法能夠檢測結(jié)核分枝桿菌混合感染，從而提高了對(duì)利福平耐藥性檢測的敏感度。同時(shí)對(duì)異煙肼的敏感度(83.1%)高于線性探針(77.4%)[6]和基因芯片(80.9%)[7]，一方面，熔解曲線法能夠檢測混合感染；另一方面，熔解曲線法不僅檢測包括katG和inhA兩個(gè)耐藥相關(guān)基因，同時(shí)也檢測oxyR-ahpC基因。有研究表明，我國對(duì)異煙肼耐藥的菌株中有約3%攜帶oxyR-ahpC基因突變，因此熔解曲線法藥敏試驗(yàn)檢測的覆蓋范圍更廣，可以提高對(duì)異煙肼耐藥性檢測的效能[8]。

表1 以MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)為參考標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)熔解曲線法檢測利福平、異煙肼耐藥性的效能

雖然本研究表明熔解曲線法與MGIT 960 液體藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果具有較高的一致性，但是也發(fā)現(xiàn)兩者檢測結(jié)果存在不一致的情況，對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性檢測陽性檢出率也存在差異，這種差異是客觀存在的；分子生物學(xué)檢測技術(shù)檢測耐藥結(jié)核病的敏感度尚未達(dá)到100%，對(duì)利福平和異煙肼耐藥性檢測的敏感度僅為95%和85%[9]；分子生物學(xué)檢測方法通常在標(biāo)本中耐藥結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群占比高于20%以上時(shí)才能檢出，因此造成部分耐藥結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的漏檢[10]，表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果通常為耐藥的結(jié)果；而熔解曲線法可能無法檢出耐藥結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群占比低于20%的標(biāo)本，導(dǎo)致將標(biāo)本判定為敏感。表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果雖然是當(dāng)前耐藥性檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但仍存在局限性，往往對(duì)于一些低水平耐藥的菌株存在漏檢的情況；如分子藥敏試驗(yàn)檢測出rpoB基因511位點(diǎn)和inhA突變時(shí)，表型藥敏試驗(yàn)往往檢測結(jié)果為陰性，因此造成兩種方法檢測結(jié)果不一致[11]。有研究表明，如果分子藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果為耐藥，而表型藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果為敏感時(shí)，進(jìn)行再次重復(fù)檢測，通常為表型藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果錯(cuò)誤[12]。另外，引起耐藥的機(jī)制有3種，分別是細(xì)胞壁通透性改變、外排泵機(jī)制和基因突變[13]。熔解曲線法只是檢測基因突變，如果是基因突變外的耐藥機(jī)制引起，就會(huì)導(dǎo)致表型藥敏試驗(yàn)?zāi)退幎劢馇€法檢測敏感的情況。

總之，以MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)作為參考標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)熔解曲線法藥敏試驗(yàn)檢測利福平和異煙肼的耐藥性具有較高的一致性，Kappa值均>0.75，一致性非常好。熔解曲線法能直接采用痰標(biāo)本進(jìn)行耐藥性檢測，不需得到臨床分離菌株，大大縮短了檢測時(shí)間；具有對(duì)利福平和異煙肼耐藥檢測簡單、快速、敏感度高、特異度好的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于耐多藥肺結(jié)核的早期診斷有重要意義。