朱國峰 劉曉清

結核病領域每一個歷史性階段的進步發(fā)展都有著共同的歷程和特點，即在當時已有的先進技術和理論基礎上，通過一定階段系統全面的實驗、觀察和總結，形成水平與能力都得到提高和發(fā)展的新的階段性的結論、認識和問題。在這個階段技術能力支持下的成果獲得日益豐富的積累，也就必然會提出新的有待深入研究的問題，要求更進一步的工作和新技術來解決這些問題。也就是說，每一個階段科研的成熟和進步，都在為下一個階段升級的科學研究和進步提供研究所需要解決的科學問題和社會需求，同時對解決這樣的科學問題所需要的功能技術提出了方向和要求。在國際結核病研究領域中，從20世紀90年代初到現在，這個規(guī)律表現得尤為突出。

以1998年結核分枝桿菌(MTB)全基因組測序完成為標志，全球結核病免疫學研究已經進入了分子免疫學的全新時代。隨著MTB基因敲除突變體技術的成熟和普及，隨著全球結核病新型有效疫苗和藥物研發(fā)評價需求的日益迫切，隨著結核病小鼠、豚鼠和猴子三種動物模型全面的建立和成熟，作為結核病領域研究的核心技術和理論，結核病分子免疫學的研究迅速跨入一個急劇擴張和爆發(fā)的全面創(chuàng)新階段。

以MTB基因敲除突變體和動物模型兩大類技術為核心的結核病免疫學研究，正在逐漸積累并形成結核病比較免疫學數據體系(不同宿主類型結核病免疫反應特征，MTB不同基因免疫調控功能)，為我們全面深刻認識結核病的免疫控制機理，以及深刻認識掌握宿主免疫反應調控機理和技術，為全新的結核病疫苗研究、結核病新藥物研究、結核病新型免疫診斷技術研究提供了前所未有的機會和可能。我國結核病基礎研究和應用研究的水平和未來，能否在全球結核病疫苗、藥物和診斷技術的競爭中占據一席之地，其關鍵就在于能否把握住結核病比較免疫學形成和發(fā)展的這個歷史機遇，形成真正具有國際水平的結核病免疫學科學和技術研究的實力和能力。

一、結核病免疫學研究的重要性

(一)MTB感染的特點

1. 胞內菌。MTB是一種巨噬細胞內寄生的高度適應宿主免疫反應的致病細菌，無論在體內生長還是體外培養(yǎng)，MTB都表現出生長緩慢的特點。在研究中發(fā)現，MTB在很多細胞中都能表現出對宿主細胞內環(huán)境很強的適應性，如抵御NO等含氮活性化合物，抑制細胞膜融合等[1]。

2. 潛伏感染。在絕大多數的感染事件中，MTB的感染并不直接導致宿主發(fā)病，而是以潛伏的狀態(tài)存在于宿主體內一種特別的結構中，也就是結核肉芽腫中。結核肉芽腫是由多種免疫細胞聚集復合而成的病理結構，多數情況下宿主能夠有效將細菌控制在肉芽腫組織中而健康地生活[2-3]。

3. 潛伏感染復發(fā)。在潛伏感染的過程中，當宿主不能將細菌有效控制在肉芽腫組織中時，宿主將會發(fā)病。這樣的情況多數發(fā)生在宿主免疫反應抑制時，如罹患艾滋病和臨床應用免疫抑制劑治療自體免疫性疾病，以及在營養(yǎng)不良的情況下[3]。

(二)人類對疫苗的需求和努力

卡介苗(BCG)是一種減毒的牛分枝桿菌，是全球唯一廣泛使用的抗結核疫苗，從1921年起，全球至少接種了30億份BCG。在成年人中，BCG的保護效率在不同的臨床試驗中表現出很大的差異，從0.0%到80.0%的數據都有。尋找更安全和更加有效的結核病新疫苗，是全球結核病防控的迫切需要[4]。

在近年來的結核病疫苗研究中，下面2個候選疫苗的臨床試驗結果需要大家有正確的認識和理解。

1. MVA85A。這是進入21世紀以來曾經寄托了所有人最大希望的一個結核病新疫苗。這個疫苗以表達Ag85A免疫原的Ankara病毒為載體，通過表達抗原85A以提高接種過BCG的嬰兒(4～6個月齡)保護效果。隨著在2013年該疫苗評估的臨床2b期試驗結果公開發(fā)表，無明顯保護效果的結論再一次強烈提示：在對于結核病免疫反應特性認識仍然非常淺顯的情況下，尋找和發(fā)現結核病新疫苗是需要對結核病保護性免疫反應有更多研究才會成為可能[5]。在結核病免疫機理研究和新型疫苗研究的歷史上，MVA85A的研發(fā)過程和結果具有非常重要的理論和技術價值，即試圖用簡單盲選的辦法挑揀免疫原開發(fā)結核病新型有效疫苗的方法，對于結核病這樣免疫過程機理復雜的傳染病是行不通的。只有對于結核病的免疫機理有了充分翔實的實驗機理研究后，才有可能研發(fā)出新的、有效的結核病疫苗。

2. M72/AS01E。這是一個以MTB32A和MTB39A兩個MTB蛋白為免疫原，結合AS01佐劑的結核病新疫苗。臨床試驗評估人群為18～50歲且無HIV感染的MTB潛伏感染者。在2018年發(fā)表的該疫苗臨床 Ⅱb 期評價的結果顯示，與接種安慰劑對照的測試組相比，其對MTB潛伏感染者的保護效率為54%。這個結果顯示，關于這個候選疫苗的作用仍需要進一步評價，尤其是要對不同類型人群進行多點評價[6]。

(三)缺乏保護性免疫反應的標志

宿主對MTB的控制是非常復雜活躍的一系列免疫活動。在這個過程中，主要的免疫細胞(如巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞等)都在其中扮演著一定的角色。然而在對結核病保護性免疫反應的判斷標準上，卻始終缺乏明確的判斷方法。MTB能夠激發(fā)宿主強烈的免疫反應，但在諸多不同的反應中，哪些反應是對宿主起保護作用的？哪些反應是有利于細菌感染和存活的？哪些反應對MTB控制不起作用的？對這些問題的了解還是非常不足的。

在以往結核病新疫苗的研發(fā)過程中，對于免疫原的來源，多數是基于早期對MTB培養(yǎng)基過濾物中分離蛋白成分的遴選。對于能夠引起宿主免疫反應的蛋白，往往傾注了非常多的希望和努力。然而在經過長期的研究和評價后，對于結核病保護性免疫反應的特點，仍然沒有太多的理解和認識。因此，要想確切地站在科學的角度理解和推進結核病新疫苗的研發(fā)，就必然需要應用可以準確控制的動物實驗研究，系統地分析結核病的免疫反應特點和類型，進而從中發(fā)掘對結核病保護性免疫反應的特征特點。

二、結核病免疫學研究難度大

(一)MTB復雜的生物學特性

1. 基因組龐大。隨著第一個分枝桿菌菌株(實驗室菌株H37Rv)全基因組序列的完成，讓我們真正能夠從遺傳構成上開始了解和認識導致結核病的致病菌[7]。H37Rv基因組由4 411 532個堿基組成，G+C含量為65.6%，4043個基因編碼了3993個蛋白和50個RNA。在隨后其他各種菌株測序結果陸續(xù)完成后，包括基于基因組序列對MTB和BCG比較，讓我們更加認識到僅僅獲得基因組序列對認識結核病的發(fā)病機理還是遠遠不夠的。復雜的遺傳組成帶來復雜的致病機理。

2. 生長緩慢。在結核病的研究中，令人極為困惑的一個問題就是“為什么MTB的生長速度非常緩慢”。這除了在臨床診斷上會帶來不同于其他細菌的特別問題外，在藥物治療和科學研究中都成為需要特別關注的問題。痰液中分離的菌株在固體培養(yǎng)基上生長需要2～4周的時間，而從動物組織中培養(yǎng)分離菌株需要4周左右的時間。這導致對MTB的研究需要超出其他研究較多的時間和準備工作。

(二)動物實驗條件要求高

1. 生物安全。研究病原菌致病機理的工作是離不開動物模型的，而進行結核病動物模型實驗需要在生物安全三級實驗室(BSL3)進行。由于結核病動物實驗研究的核心問題是潛伏感染和潛伏感染復發(fā)，所以從細菌感染動物直到被感染動物進入穩(wěn)定的潛伏感染狀態(tài)，需要足夠長的時間才能實現(如小鼠，感染4～6個月后進入穩(wěn)定的潛伏感染狀態(tài))。所以，相關研究從實驗室運行成本、實驗技術內容及實驗條件要求等都是很高的。而對于結核病發(fā)病機理的研究，以及基于這些動物研究的新藥物研發(fā)評價和疫苗研發(fā)評價，都必須有成熟可靠的動物實驗支撐才能進行。

2. 經濟成本。BSL3日常運行費用、動物管理實驗費用，尤其是帶菌狀態(tài)活體動物的管理，決定了結核病的動物模型實驗成本比較高。尤其是在使用特定遺傳特性小鼠品系，使用一定數量的豚鼠，或是使用非人靈長動物進行研究時，這些實驗的難度和物資消耗成本較一般的動物實驗高。

3. 研究技能培訓時間?，F代結核病免疫機理的研究，是一個集合了分子生物學、免疫學、細胞學、分子遺傳學、生物化學、生物物理學、結構生物學、生物信息學等多種學科技術方法并不斷成熟和發(fā)展的研究體系。在成熟的結核病動物實驗技能培訓中，對于科研人員必須掌握相關技能的訓練和培養(yǎng)往往需要通過6個月以上的時間，才能完成對一個可獨立從事結核病動物實驗人員生物安全操作技能的培訓。

(三)動物實驗的周期長

1. 潛伏感染是重點。結核病的特點是潛伏感染和潛伏感染復發(fā)，因此結核病免疫機理的研究首先就是潛伏感染形成的機理和特點。相對而言，結核病動物模型研究的重點，是在確定細菌成功感染的基礎上進入潛伏感染的狀態(tài)。所有能夠影響感染成功、能夠影響進入潛伏感染狀態(tài)、能夠成功保持潛伏感染狀態(tài)的現象和條件都是研究的重要領域和方向[8]。

2. 潛伏感染復發(fā)控制。這是造成臨床實踐中結核病發(fā)生發(fā)展復雜性的根本原因。在可以明確發(fā)病的情況下，應對的手段和方式也是可以明確的。對于攜帶MTB的潛伏感染者，究竟其在什么樣的條件下會發(fā)生結核??？發(fā)生結核病的原因和特征是什么？這些仍然有待深入研究解決的問題，使得控制結核病這樣一個呼吸道傳播的傳染病變得極其復雜和困難。在動物模型的研究中，就是要在可控條件下，充分研究造成潛伏感染復發(fā)的條件和方法，深入理解認識其復發(fā)的原因機理，從而為結核病臨床的早期診斷技術、免疫控制技術和疫苗的研究開發(fā)，提供系統的數據支持[9-10]。

(四)感染免疫反應的復雜生物學基礎

1. 細菌的遺傳特性。在基因組構成上，通過對MTB臨床菌株CDC1551全基因組序列的分析，可以發(fā)現CDC1551與H37Rv在86個位點上有超過10個堿基的插入或缺失，有1075個點突變[11]。牛分枝桿菌基因組序列與MTB同源性高達99.95%，但其基因組較人的小約60 kB[12]；BCG菌株的基因組序列分析顯示，較MTB和BCG菌株的基因組染色體至少有18個大的片段是缺失的，約包括120個基因[13]。

2. 宿主的遺傳特性。多樣性是自然界生物進化的必然結果。在病原與宿主的感染抵抗過程中，其中由于宿主遺傳因素帶來的免疫反應差異，是決定MTB與宿主互作過程中是否發(fā)病至關重要的因素。然而到目前為止，人類對結核病相關宿主遺傳因素的了解仍然是初步且是非常有限的[14]。進一步深入研究人的遺傳基因變異在結核病發(fā)病過程的作用，對于結核病疫苗研發(fā)和臨床治療技術的提高，對于臨床結核病治療和預防效果的改善都會產生重要影響[15]。

(五)MTB感染、致病、毒力研究技術

1. 發(fā)現遺傳學上的因果關系。這是當代創(chuàng)新藥物和疫苗研發(fā)的關鍵所在。我們已經觀察到MTB能夠引發(fā)宿主非常強烈和復雜的免疫反應，但是對于這些免疫反應各自的生物學功能和意義的認識卻仍然處在很原始的階段。隨著MTB基因組測序工作的完成，我們有機會在遺傳控制的層面詳細而全面地對MTB每一個基因在細菌生物學功能、致病過程的作用，以及其作用的分子機理進行分析研究，從而深入了解MTB基因組中每個基因在結核病發(fā)生過程中所起的作用和作用方式是什么。一旦落實了感染與致病間的因果關系，對于結核病的治療和控制也就到了要發(fā)生突破的地步了。

以這樣一種前所未有的新技術高度對結核病免疫機理進行全面的研究，是因為支持這種研究所需要的系列技術手段已經得到了突破。這里有3個關鍵的技術：第一是MTB全基因組測序完成，這樣就允許我們針對其基因組的構成進行相關的基因工程操作；第二是MTB基因敲除技術的成熟，通過定向構建特定基因敲除的突變體，就允許我們對目的基因的生物和病原學功能進行一對一的針對性研究；第三是可以較好模擬人結核病特點的慢性結核病動物模型。

同任何重要生物學研究和疾病研究的過程一樣，對結核病的研究也是在通過對臨床大量疾病現象的觀察開始的。在遺傳學技術不夠成熟的情況下，主要是通過對各種現象進行觀察和統計分析，確定疾病的各種客觀性狀反應。而在具備了不斷完善成熟的分子、免疫和遺傳學技術方法后，借助這些技術方法對造成結核病各種病理性狀的機理進行更加深入的研究，將成為今后進一步提高對結核病診斷、治療、藥物和疫苗研究水平和能力的必然趨勢。

2. 細菌基因影響的宿主免疫反應。正如早期致病菌研究中普遍發(fā)生的現象那樣，對于能夠在培養(yǎng)條件下分泌到培養(yǎng)基中的細菌蛋白等產物，自然會引起研究人員的興趣，這些產物也就是最早跟隨生物化學等技術手段的發(fā)展而被重點研究的對象。但是隨著相關領域技術和研究的不斷積累和發(fā)展，對這些問題的理解就有了更加深入的認識和提高。比如，這些體外培養(yǎng)狀態(tài)的分泌物，在細菌感染宿主細胞時是否一定會分泌到環(huán)境中去？這些進入宿主細胞的MTB如何將分泌到細胞中的產物遞送到宿主細胞外的？這些被用來影響宿主免疫反應的產物都是由細菌中哪些基因控制的？其基因控制的分子機理是什么？

在MTB免疫反應的研究中，除了其編碼的蛋白質外，在MTB細胞中含量特別豐富的糖類和脂類產物，也是非常重要的研究對象。然而由于技術上對這些物質的分離提純難度大，使得對于其相應的生物和病理研究也就相對較少。近年來，隨著MTB遺傳操作技術的發(fā)展，通過對糖類和脂類產物生物合成及代謝基因的敲除，研究者有了對這些生化物質的代謝機理和意義進行深入研究的機會，同時也能夠對這些產物在結核病發(fā)生過程中的作用及作用原理進行深入的研究[16]。

由于我們已經知道了MTB全部的遺傳構成，已經掌握了對其基因進行遺傳操作的技術和能力，在這樣的技術條件下，不僅可以對MTB作為一個普通微生物進行生物特性調控規(guī)律的分子機理研究，也可以在感染宿主的過程中對其致病、潛伏和復發(fā)的病理特性調控規(guī)律的分子機理進行系統的研究。落實到宿主的免疫狀態(tài)上，借助于病原菌基因敲除的突變體技術，就可以對病原菌的基因功能及其代謝調控是如何影響宿主免疫反應的分子機理進行深入的研究。

3. 細菌多基因影響的宿主復雜免疫反應。MTB是一種非常成功的致病菌，其龐大的基因組構成也決定了其對宿主侵襲過程的復雜性。在特定病理毒力性狀形成的過程中，在長期進化過程中，往往會形成一系列的功能補償機制，即一個特定性狀的形成和維持往往是需要多個基因協同作用產生的結果。

在以往針對MTB相關復雜性狀的研究中，由于無法進行多基因敲除突變體的構建，我們也就無法對這些復雜性狀發(fā)生的機理進行全面深入的研究。當技術發(fā)展到可以構建多基因敲除突變體時，針對MTB生物學功能和致病能力的研究即可進入到一個非常令人激動的階段。這樣我們不但可以對由單基因決定的相對簡單的性狀機理進行研究，還可以對由多個基因協同作用的復雜性狀進行研究，這對于深入理解結核病的發(fā)生發(fā)展機理，尤其是對于深入研究宿主免疫調控的機理和方法都是一個重大的機會。

三、結核病免疫學系統研究條件的成熟

(一)MTB突變體的構建和選擇

A. 操作技術流程。B. 突變體構建示例：(1)獲得目的基因(如pncA)上下游+1000 bp的DNA序列；(2)分別設計上游(LFS)和下游(RFS)PCR擴增的引物序列；(3)將LFS和RFS序列分別克隆到穿梭質粒上；(4)完成基因敲除后，細菌基因組中原pncA的編碼區(qū)將被載體上的抗生素選擇標志基因(Hyg，即潮霉素)序列替換

1. 突變體文庫。結核病分子水平的科學研究需要分子水平的技術手段才能夠進行。當具備了MTB全基因組序列、MTB基因敲除及MTB多重基因敲除的技術之后，對MTB基因組中每一個基因在其生物學功能和病理學功能中的作用進行研究，都成為結核病致病機理研究不可或缺的工作。而構建突變體文庫，也就是構建全部每個基因都單獨敲除的突變體細菌，就成為MTB致病機理研究中前所未有的強大工具，就成為我們全面分析研究結核病分子免疫機理最重要的科學技術基礎。構建MTB基因敲除突變體的操作技術流程和示例見圖1。

2. 可借鑒類比的基因。所有的研究都是從每一個具體的編碼基因開始的。在一個具體的研究工作中，究竟挑選哪一個基因進行研究，這是每位科研人員必然要進行選擇的。一般的選擇方式，是通過其他比較詳細的微生物的研究，或從其他領域前人的研究結果中尋找類似功能過程的控制基因，再開始進行自己在MTB致病性中的研究。這種方法就是通過借鑒類比的方法，來選擇自己個人傾向性的研究對象。這樣選擇的優(yōu)點是：相應的實驗走向預期有直接的類比參考，實驗的路線和具體技術內容相對容易選擇和預期。

3. 有突出興趣分析的基因。這是一種具有強烈個人興趣的研究選擇。有的人對耐藥特性有興趣，所以會首先選擇耐藥的相關基因進行研究；有些人對細菌基因表達調控的分子機制有興趣，所以會選擇一些轉錄調控因子的編碼基因進行研究；有些人對細菌細胞壁的特殊組成有興趣，所以會選擇與糖類和脂類合成代謝有關的基因進行研究。在這樣不同的基因功能的研究中，即便我們對選定的基因功能有了預期和希望，但在完成實驗得到具體客觀研究數據之前，經常會有令人意外和驚喜的新發(fā)現。

4. 功能全新或功能未知的基因。對這些基因功能的研究往往挑戰(zhàn)比較大，因為前期可參考的工作比較少，每一步的研究都可能會有很大的意外結果。對于MTB這種致病能力非常特別的病原菌來講，在與宿主相互作用中有特別的病理表現，如胞內寄生、潛伏感染、潛伏感染的復發(fā)等，對這些復雜的關鍵性問題的解答也就使得對功能未知的基因或是已知基因的未知功能的研究成為非常令人向往的研究工作。

MTB基因敲除技術的發(fā)展和成熟，促使我們可以對MTB所有編碼基因在結核病發(fā)生中的作用進行研究和分析。在此基礎上，結核病免疫機理研究和結核病有效控制技術也可達到一個全新的高度。以往只能在觀察基礎上進行統計和猜測，現在就有可能通過分子遺傳學研究的技術，進一步將研究推進到相關性狀的因果關系的分子功能機制水平上。在這樣的形勢下，結核病領域中科研人員是否普遍掌握和熟練應用MTB分子遺傳學研究技術，已經成為當前全球結核病研究領域研究能力高低評判的客觀標準。

(二)結核病研究實驗動物模型的成熟

1. 小鼠模型。這個模型是最成熟最普遍的結核病研究模型。其優(yōu)點是：第一，實驗成本低，容易操作，可以進行具有足夠數量動物的研究，在結核病免疫研究和藥物及疫苗篩選中具有重要價值；第二，小鼠種系遺傳背景清晰，是可以非常穩(wěn)定重復和應用的結核病研究模型；第三，已有的結核病動物免疫機理研究，幾乎全部都是通過小鼠結核病模型研究獲得的成果。小鼠模型不足之處是其結核病理過程與人結核病差異較大，比如低劑量潛伏感染模型中肺部細菌載量很高，小鼠結核肉芽腫與人結核肉芽腫結構差異很大，尚不能完全模擬人的結核病特點[17]。

2. 豚鼠模型。這是最早在結核病研究中用到的動物模型，其肉芽腫組織與人的結核病肉芽腫組織很像，如出現組織壞死以及形成多核巨大細胞等。這個模型是結核病疫苗和新藥物效果評價非常重要的技術手段。豚鼠模型的局限性主要包括實驗成本比較高，另外豚鼠研究所需的相關免疫實驗試劑比較少，所以除了對疫苗和藥品效果的評價研究外，真正基于豚鼠模型對結核病免疫機理的研究仍然非常有限。

3. 非人靈長動物(猴子)模型。雖然這樣的模型非常昂貴，但由于這是所有結核病研究動物模型中最接近人的動物研究，所以基于猴子的結核病研究仍然是非常迫切和重要的。在結核病藥物和疫苗研發(fā)評價中，猴子模型的工作是必須進行的，因此近10年來這個模型的結核病研究工作發(fā)展非?？?。結核病猴子模型的主要局限性：一是價格昂貴，二是生物安全控制難度大，三是個體間遺傳差異大。雖然其研究的免疫試劑類型比豚鼠要多，但在進行全面免疫實驗研究分析中，可用的實驗試劑仍然有待填補充實[18](圖2)。

四、結核病比較免疫學的形成

(一)臨床疫苗和藥物研發(fā)必須的實驗過程

簡單卻又必須明確認識的一個問題，就是結核病是嚴重危害人類健康的傳染病。在缺乏有效的新型疫苗，缺乏廣泛可選的治療藥品，缺乏對潛伏感染復發(fā)診斷有效評價診斷技術的情況下，對人結核病發(fā)生發(fā)展過程中的免疫機理研究，是最終實現人類終止結核病目標無可回避的必然選擇。在沒有任何可能用人來進行MTB感染系統實驗研究的情況下，要想做到這一點，就必須借助動物模型的研究來幫助認識臨床結核病的發(fā)病機理。

同時，這也是由臨床結核病治療藥物和疫苗研發(fā)必須的技術過程所要求和決定的。在最常用到的3個結核病動物模型中，每個模型都有著各自的優(yōu)點和缺點。在當前階段下，一個是為滿足臨床藥物和疫苗評價研究的需要，一個是充分研究不同宿主結核病發(fā)病特征機理研究的需要，小鼠、豚鼠和猴子結核病模型都是必然需要的，是不能缺少的。

(二)不同宿主類型結核病免疫反應的異同

對于小鼠、豚鼠和猴子被MTB感染和發(fā)病確切的免疫反應過程的認識仍然是比較粗淺的，比如在這3種動物結核病發(fā)病過程中，其各自總體的免疫反應究竟都有哪些不同？這些不同的免疫反應的生理功能究竟是什么？這些免疫反應的病理意義又是什么？什么樣的免疫反應是宿主的保護性免疫反應？由于這些基礎的研究和數據非常有限，所以難以滿足我們對結核病發(fā)病機理認識的需要。

(三)結核病相關保護性免疫反應的研究認識

在結核病免疫反應的研究中，一個特別迫切需要并希望能夠有所進展的，就是不同動物間結核病的保護性免疫反應是否相同？不同動物各自的保護性免疫反應分別是什么？如何將結核病臨床檢測觀察的數據對應到基于結核病動物模型的研究數據中？這樣的數據和結果對于結核病新藥物研發(fā)和疫苗研發(fā)都是極其寶貴和重要的。借助于這些動物模型進行翔實而系統的實驗研究，人類對結核病的發(fā)生發(fā)展機理就會真正有了質的飛躍，對于研發(fā)臨床結核病有效新藥物和疫苗的評價分析就會更加可靠和有目的性。

A. 結核病動物模型技術。B. MTB基因敲除技術

(四)研究數據積累豐富后的必然結果

在無法評價宿主有效免疫反應特點的情況下，通過不同動物模型進行的結核病研究依然處于數據積累和觀察的階段。另一方面，基于小鼠、豚鼠、猴子的不同物種遺傳背景的系統研究，為進一步的研究創(chuàng)造了一個重要的機會，即對不同基因敲除的MTB突變體在感染不同生物宿主時，其對宿主的免疫反應調控結果是什么。伴隨著這些研究的深入開展和數據積累，人類對于結核病的發(fā)病機理和疾病可能的控制技術研究，也就到了一個全新的階段和時刻。這個時段的認識既包含不同免疫遺傳構成下宿主應對MTB感染的免疫調控反應，也包括不同基因缺失突變后MTB對宿主免疫反應的影響。

(五)發(fā)掘結核病臨床數據價值的技術框架需要

雖然結核病的動物模型不能完全模擬人的結核病發(fā)病過程，但利用MTB突變體文庫進行系統的研究卻是必須的，也是只能在動物模型上才可以進行的。我國擁有龐大的MTB感染人群，通過結核病患者、MTB潛伏感染者、未感染者臨床樣本的收集和分析，可以獲得豐富的MTB感染免疫反應的臨床資料和數據。這樣的臨床資料和數據，再結合通過3種結核病動物模型的精確研究獲得的系統而豐富的科學數據，使人們有機會獲得不同類型個體間結核病保護性免疫反應的認識，從而為臨床上結核病的精確診斷、治療和預防提供前所未有的機會和工具。

(六)打開宿主免疫調控研究的大門

無論是各種腫瘤和自體免疫性疾病治療中的抗體藥物，還是各種免疫調節(jié)治療使用的佐劑類藥物，都是利用對宿主免疫調控的干預來實現臨床治療的目的。從廣義的角度上講，免疫調控對于疾病的治療和疫苗的使用都是技術手段的核心。由于MTB天然的免疫調控能力，可以引發(fā)復雜而強烈的宿主免疫反應，在研究厘清其在結核病控制中的作用和意義的同時，結核病免疫機理的深入研究也正為今后宿主免疫調控技術和產品的研發(fā)利用提供了一個非常特別的歷史性機遇。

一方面，通過對小鼠、豚鼠、猴子、人類結核感染和結核病免疫反應及其調控機理的研究，將會充分理解認識在不同遺傳組成和背景下，不同免疫反應調控類型的生物學機理是什么。另一方面，對其他不同類型疾病免疫調控變化進行研究分析，將其與結核病相關過程中免疫調控特點進行比較，進一步理解宿主特定免疫調控過程在疾病或健康維持過程中的免疫學意義。再一方面，就是通過借鑒結核免疫調控機理的原理，對包括結核病及更多類型其他疾病的保護性免疫反應進行認識和研究，從而為更加深刻全面理解認識宿主免疫調控分子機理，并加以利用發(fā)展為新的疾病預防、診斷、治療和研究的技術產品資源。

五、基于細菌基因功能分析的結核病免疫學研究技術路線

雖然針對每個基因功能及其在宿主免疫反應中的影響，具體的研究技術路線會有不同，但就具體實驗研究過程來講，基于MTB基因突變技術和動物模型相關研究的核心技術路線是基本一致的。從當前結核病領域核心研究技術的發(fā)展需要和成果遞進情況來講，結核病比較免疫學的核心技術過程包括以下幾個方面的主要內容。

(一)野生型和突變體的平行實驗

1. 對照的價值。在結核病免疫機理的動物模型研究中，在標準的衛(wèi)生環(huán)境條件下，利用遺傳組成穩(wěn)定的動物宿主和單克隆化的標準實驗室MTB菌株(H37Rv和Erdman)，建立可穩(wěn)定重復的結核病發(fā)病過程模擬，這就是結核病研究的動物實驗模型。其中通過大量長期實驗研究積累的野生型MTB感染宿主導致的宿主結核病病理反應，就是標準實驗條件下該動物模型中結核病的典型表現性狀。有了這樣的成熟動物模型條件，對MTB基因在侵襲宿主時決定和參與影響的免疫反應機理的研究，才真正具備了可靠的模型實驗條件。

在所有針對特定基因敲除突變體的動物實驗研究中，野生型菌株的對照實驗始終都是必不可少的。用野生型的MTB感染動物，目的就是獲得在正常MTB感染及發(fā)病過程中，宿主穩(wěn)定的標準免疫反應。野生型MTB在每個獨立實驗中的作用，一方面，這是對所有實驗操作過程質量可靠性的評價方式；另一方面，這是不同研究人員各自獨立的實驗結果數據可比性分析的基礎；再有一方面，這更是構建完整結核病免疫反應調控數據體系必須的質量控制基礎[19-20]。

2. 研究數據的可信度。結核病科學實驗研究中，首先需要保證的是目的研究變量必須是唯一的。日常生活中，很多人習慣將諸多變量投入到一個問題的討論中，甚至同時將2個以上的變量放在一起進行所謂的“研究”，這種雙重不確定性的討論在實驗科學中是必須排除的。所以在精確的MTB基因功能分析中，一個必須明確的原則就是針對這個基因功能的研究必須是建立在對這一個基因進行敲除的突變基礎上。當將這樣的目的基因特異敲除形成突變體后，與野生型菌株相比較，突變體菌株只是缺少了這個被研究的目的基因，而其他所有遺傳組成與野生型菌株是完全相同的。這樣，在隨后實驗中所觀察到的所有性狀改變，才可能是這個被敲除基因所帶來的結果。

有了野生型菌株的實驗作為對照，通過對野生型菌株感染動物形成的結核免疫反應的穩(wěn)定與否，首先可以判斷的就是這個實驗操作是否正確可靠。在此基礎上，作為目的基因突變的菌株感染所引發(fā)的宿主免疫變化，才可能是真正客觀的宿主免疫調控能力的變化。

3. 突變體回補。早期的研究中，能夠獲得基因突變的菌株已經是很不容易的工作了。但是實驗中僅有基因敲除的突變體數據并不能完全保證觀察到的現象完全是由這個基因敲除所導致的，因為在類似MTB這樣的原核生物中，線性排列的基因之間往往相隔不遠，有些基因的編碼區(qū)域甚至是相互重疊的，這就存在著一種可能，即當我們敲除某個特定基因的時候，實際上與之相鄰的另外一個基因的功能也受到了影響，從而導致在動物感染實驗中觀察到的性狀改變是由這個相鄰基因功能的變化所導致的。

所以在基因敲除突變體的研究分析中，同時還必須構建另外一個菌株，即把被敲除的基因克隆在一個MTB的質粒表達載體上，重新轉回到該基因敲除的突變體中，使得這個原有位點缺失的基因又被補回到細菌當中。當這個突變體回補菌株的動物實驗數據與野生型菌株動物數據一致或基本一致的時候，也就完全證明在突變體菌株動物實驗中所看到的性狀變化就是由于這個基因的缺失所導致的。這樣也就從實驗上證明了這個被研究的目的基因在結核病發(fā)病過程中的作用[21]。

(二)標準的動物模型

1. 感染方式。以呼吸道感染的方式接種MTB，這是最理想的結核病動物模型的細菌接種方式。這樣的模型因為在感染的方式上最大程度地模擬了MTB的自然感染過程，所以在宿主的發(fā)病過程中所產生的相關免疫反應也與結核病自然發(fā)生發(fā)展的過程最接近。目前通過呼吸道氣溶膠方式感染小鼠和豚鼠的動物模型已經非常成熟，而猴子則主要是通過氣管鏡接種的方式進行[22-23]。

2. 感染劑量。在呼吸道感染的結核病動物模型中，感染劑量的控制是核心技術參數。在高劑量MTB的感染中，宿主(動物)往往由于無法有效控制細菌的感染，一經感染即會發(fā)生嚴重的疾病甚至死亡。這樣的感染和發(fā)病方式由于無法形成穩(wěn)定的潛伏感染狀態(tài)，因此也就無法成為可以替代臨床癥狀進行系統免疫機理研究的結核病動物模型。

低劑量感染模型是當前結核病動物模型研究的通用模型。在小鼠結核病動物模型中，當呼吸道接種菌株數為個位數的情況下，就可以形成穩(wěn)定而標準的慢性結核病發(fā)病模型。同時由于低的感染菌株量能夠更加真實地反映自然界中MTB初始感染的特點，所以低劑量感染的動物模型是當前各種結核病動物模型研究中普遍采用的研究方式。

3. 潛伏感染。由于MTB是一種胞內菌，在其成功感染宿主細胞后，最常見的情況是MTB以一種被局限約束的非活躍狀態(tài)存在，被宿主免疫系統有效地控制住，這就是MTB感染中非常特別的潛伏感染，即帶菌而不發(fā)病。對于潛伏感染的人群來講，在宿主正常健康狀態(tài)下體內的MTB是不會引起宿主發(fā)生結核病的。在結核病的動物模型研究中，建立體內能夠攜帶細菌長期存在而又不會發(fā)生活動性結核病的模型，就是典型而理想的結核病潛伏感染模型。對于結核病免疫控制機理的研究而言，早期的工作主要是進行建立這種理想的結核病實驗動物模型的研究[24-25]。

4. 潛伏感染的復發(fā)。在臨床患者中，絕大多數的結核病患者是從潛伏感染狀態(tài)轉化成為活動性結核病發(fā)病狀態(tài)的，因此對于成功的結核病動物模型來講，能夠進入潛伏感染狀態(tài)，并且能夠可控制地由潛伏感染狀態(tài)進入活動性結核病發(fā)病狀態(tài)，決定了這個動物模型在結核病研究中的實際應用價值和意義。在當前采用的慢性結核病動物模型中，小鼠模型在潛伏感染復發(fā)研究中是最成熟的，雖然這個模型的病理過程與人結核病病理有很大的差別，但目前關于結核病潛伏感染和潛伏感染復發(fā)免疫機理的認識，絕大多數都是通過小鼠慢性結核病模型的實驗研究獲得的。而豚鼠和猴子慢性結核病復發(fā)的模型構建工作也在進一步的完善過程中[10，26-27]。

(三)動物實驗研究的重要數據內容

下文以小鼠動物實驗為例，對在比較免疫機理的研究和數據體系中，標準的結核病動物實驗需要收集和觀察的關鍵研究數據進行解釋。

1. 感染劑量和組織的細菌載量。這是所有結核病動物模型研究的一個基本的標準性數據。一般在呼吸道接種的“零日”，也就是接種后的第一天，通過對細菌感染后的實驗動物組織感染細菌的數量進行確定，這是感染劑量。再一個是在確定的時間點對感染的動物組織細菌的數量進行確定，這就是這個感染時間點細菌的組織載量。

具體的操作過程就是對相應數量感染小鼠的肺、脾、肝進行組織研磨，進行系列稀釋后涂抹于培養(yǎng)基上，經過4周溫箱培養(yǎng)后，通過培養(yǎng)皿上細菌的數量確定其接種感染的最初菌量是多少，確定每個時間點組織中細菌載量是多少。被感染動物的組織細菌載量是結核病病理分析和實驗過程質量控制最根本，也是最準確的評判標準[28]。

2. 感染的組織病理。除了對實驗動物組織中細菌的載量進行分析外，對于每個對應時間點的動物組織(主要是肺、脾、肝)進行病理切片分析，也是確定結核病發(fā)病過程的重要的研究數據。

基本的病理切片，主要是通過HE染色觀察組織中結核病理組織反應的情況；更復雜的病理切片，則是需要對病理組織中相應目的細胞或蛋白質的組成存在進行免疫組化的染色分析，這樣就可以更加精細地觀察和分析結核病病理代謝發(fā)展的過程[29]。

3. 系統的體液免疫反應。在各種結核病動物模型的研究中，隨著技術的發(fā)展和進步，在一般病理進程觀察的基礎上，已經需要并能夠開展系統的結核病體液免疫反應數據的獲取和研究了。盡管MTB能夠引起宿主強烈的系統性抗原抗體反應，但由于在已有的試圖應用抗體鑒別和結核病治療中沒有成功的案例，所以對于B細胞介導的體液免疫反應在結核病控制中的作用和意義，目前的理解和認識是缺乏普遍統一的明確結論的。

然而對于結核病免疫反應過程中，究竟是否存在具有保護性意義的體液免疫反應？能夠激發(fā)宿主保護性體液免疫反應的免疫原是什么？能夠引發(fā)宿主保護性免疫反應的免疫原究竟有多少？這些保護性體液免疫反應的作用機理又是什么？如何利用這些保護性體液免疫反應進行疫苗和診斷技術研發(fā)？想要認識和回答以上類型的問題，首先就必須通過系統的臨床樣本分析和動物模型實驗，將所有結核病相關宿主體液免疫反應的免疫原系統發(fā)現和鑒別出來，而這項工作正是當今結核病免疫反應機理研究最直接也是最有價值的研究工作之一[30-33](圖3)。

4. 系統的T細胞免疫反應。在與體液免疫反應同時存在并且重要的獲得性免疫反應中，對T細胞免疫反應在結核病免疫控制中作用的研究，是當今結核病免疫機理研究又一個最直接也是最有價值的研究工作之一。由于這種T細胞介導的細胞免疫反應也是基于對病原相關免疫原識別基礎上的作用，所以究竟有沒有具有保護性意義的T細胞免疫反應？具有保護性T細胞免疫反應的免疫原是什么？能夠引發(fā)宿主保護性T免疫反應的免疫原有多少？這些保護性T細胞免疫反應的作用機理是什么？如何利用這些保護性T免疫反應？對這些必須回答和研究的問題，同樣必須要通過系統的臨床樣本分析和動物模型實驗，將結核病相關的全部宿主T細胞免疫反應的免疫原系統地發(fā)現和鑒別出來[34-35](圖4)。

由于研究技術的迅速發(fā)展和成熟，基于小鼠、豚鼠和猴子的結核病體液免疫原和細胞免疫原的系統發(fā)現、鑒別和作用機理研究，已經成為當前結核病免疫機理全面成熟和發(fā)展的一個新的里程碑。而結核病體液免疫和細胞免疫原譜，就是今后一個全新的更高水平階段的結核病免疫研究和預防控制技術方法研究的起點。

5. 各種功能細胞的研究分析。這是每個突變體在功能進一步細化研究中都會依據每位研究者的興趣和需要進行深入研究的一些內容。其中既有對B細胞的體外功能分析研究，又有對T細胞的體外功能分析研究，以及對先天免疫反應細胞(如巨噬細胞、樹突狀細胞)體外功能分析研究，等等。以往一般基于細胞生物學功能的研究，是一類相對獨立的宿主細胞-微生物病原相互作用分析的研究。在基于結核病系統的獲得性免疫反應機理研究中，對可能引發(fā)系統宏觀免疫性狀變化的更基礎的更直接的功能細胞反應方式和變化，進行深入全面地分析研究，對于結核病免疫反應的形成和機理研究都是非常重要和必然要進行的進一步工作[36-38]。

6. 是否形成潛伏感染。由于對結核病免疫反應機理研究的核心是立足于人結核病免疫反應機理上的，因此能夠最大程度地滿足對人結核病模擬的結核病動物模型是最理想的?，F有的結核病動物模型中，仍然沒有任何一個模型可以完全滿足以上這樣的需求。因此，能夠在一定程度上滿足研究需求的動物模型，同時互相之間又可以補充和印證的不同結核病動物模型就非常必要[39]。

到目前為止，結核病小鼠實驗模型的潛伏感染是最成熟完善的實驗模型，然而由于病理過程上的缺陷，使其在結核病發(fā)生機理研究中的價值受到很大限制。但由于小鼠可以進行純遺傳品系的控制，也就是理論上所有實驗小鼠從遺傳組成上可以是完全一致的，這就為小鼠結核病動物模型的穩(wěn)定提供了無可比擬的優(yōu)勢；同時，由于可以很容易地構建出一個針對宿主因素在結核病免疫反應中的作用的基因敲除的突變體小鼠，從而提供一個無可替代的、可更加深入研究宿主因素是如何控制結核病免疫調控機理的強大的研究工具。

豚鼠和猴子模型中存在一個同樣的限制，那就是豚鼠和猴子缺乏遺傳上純系的實驗動物品系。由于實驗中采用的不同動物個體之間遺傳組成上的差異，帶來一個不利的結果就是在被MTB侵襲的不同個體之間，其對細菌的免疫反應能力可能是存在遺傳差異的。以往由于結核病免疫研究試劑和技術的限制，對豚鼠和猴子結核病免疫機理的研究實際上是不系統和不深入的。在MTB突變體文庫技術的條件下，利用小鼠結核病動物模型深入研究結核病免疫調控機理已經成為這個領域研究和競爭的核心；而同時利用豚鼠和猴子結核病模型全面研究結核病免疫機理的研究，就成為這個領域中必須進行的新的重大機遇和挑戰(zhàn)。

7. 慢性復發(fā)的調控異同。在初步開展的實驗中，已經觀察到有些基因敲除的MTB其致病能力是降低的，有些突變體的致病能力是升高的，有些突變體是不能進入潛伏感染狀態(tài)的。由于細菌基因敲除突變體在宿主動物中引發(fā)結核病免疫反應的眾多變化，為我們在科學實驗的基礎上充分研究和認識潛伏性結核感染的機理，以及潛伏性結核感染復發(fā)的機理提供了前所未有的技術能力和機遇。

充分利用MTB基因突變體文庫，在小鼠慢性結核病動物模型的基礎上，進一步構建完善的豚鼠慢性結核病動物模型和非人靈長動物慢性結核病動物模型，并在這樣系統的動物模型基礎上，徹底研究MTB各個基因突變體在3種動物模型中能夠引發(fā)的宿主免疫反應及其相應的變化，結合我國臨床結核病患者廣泛的結核病免疫反應數據，將會為結核病免疫機理的研究帶來革命性的影響和認識。

(四)數據結論的價值

1. 第一階段的核心數據框架。這個基于結核病3種動物模型的MTB全基因組突變體系統實驗研究的體液免疫反應和T細胞免疫反應數據，結合臨床各類結核病患者和潛伏感染者日益積累的豐富的獲得性免疫反應數據，就是當前新技術條件下國際水平的結核病免疫反應和免疫反應調控機理研究第一階段的核心數據框架。

結核病比較免疫學核心數據框架，具有2個維度的構成和認識能力。第一個維度是不同免疫反應構成的物種基礎，即小鼠、豚鼠和猴子，這個物種維度中之所以不包括人類，是由于這個維度的數據構成需要通過系統可控的MTB致病性感染實驗獲得，而這一點對于人類是完全不適用的。第二個維度是單獨基因缺失差異的MTB突變體(突變體文庫)，由于每一個突變體相較于野生型MTB有且僅有一個編碼基因的缺失，而所有突變體之間除被敲除的基因外其他的遺傳基因組成都是完全相同的，所以構成了對MTB每一個編碼基因在特定宿主物種結核病免疫調控中的作用認識(圖5，6)。

2. 1/4000的學術認識和成就。結核病具有復雜性，其根本原因和奧秘都存在于MTB基因組編碼的4000多個基因的遺傳密碼中。對于這樣復雜疾病的免疫機理的認識，必然是需要逐步遞次解決和積累的。無論是基于判斷和猜測的、還是沒有預先判斷和猜測的，對MTB每一個編碼基因在結核病發(fā)生發(fā)展過程中可能的功能作用的研究，都是最終真正解決結核病發(fā)病機理研究所必須的。

作為宿主-MTB互作整體調控結果的感染免疫性狀，長期的研究事實證明，必須應用先進的科學研究的技術手段，將MTB每一個編碼基因在結核病宿主免疫調控過程中的作用逐個進行研究分析，才是解決結核病問題必須的科學過程。在當前技術條件下，這樣的研究是能夠完成的。對每個MTB基因敲除突變體的3種動物模型的研究，都是結核病免疫反應調控第一階段1/4000問題的落實和解決，都將是結核病比較免疫學核心數據框架的4000個節(jié)點中的一個。

結核病標準比較T細胞免疫原譜：小鼠、豚鼠、猴子分別感染H37Rv野生型菌株后，正常結核病下各自識別全基因組蛋白質T細胞免疫原的比較；結核病基因突變體比較T細胞免疫原譜：小鼠、豚鼠、猴子各自感染相同基因敲除突變體菌株后，宿主針對該突變體感染各自識別全基因組蛋白質T細胞免疫原的比較

3. 現階段技術能力下的重要成果。在人類征服結核病的漫長過程中，離開了細致而精密的科學實驗去解決結核病免疫反應機理的想法是非常有害的。在技術和社會能力條件具備的情況下，本研究領域能力的提高和發(fā)展需要全領域的研究者都能及時地站在本領域先進科學技術水平的基礎上。在20世紀90年代，全球結核病研究再次興起的時候，在缺乏足夠分子生物學技術及生物安全三級動物實驗條件支持的情況下，我國結核病免疫研究在國際上始終處于落后的狀況。

經過近30年的社會經濟發(fā)展和技術進步，在已經掌握了結核病領域與國際同步的MTB基因敲除的先進技術，在成熟的結核病小鼠動物模型基礎上，在國際上亟待成熟完善的豚鼠模型構建上，在技術難度最大而臨床前評價意義最大的猴子模型全面成熟構建的競爭中，把握這個歷史性的發(fā)展機遇，成為當前技術條件下結核病科學和技術研究的高水平國家，從而使我國結核病免疫機理研究普遍而系統地達到國際水平，無論對于我國結核病研究的未來，還是對于結核病免疫調控機理的突破，都具有非?，F實而又重要的歷史意義。

4. 基于科學數據的新研究機會和方向。所有新學術領域的發(fā)展，都是在既有新技術條件下優(yōu)先完成本領域國際水平科學研究的基礎上必然要發(fā)生的事件。在結核病必須來自3個動物模型的系統研究中，就如當初MTB基因組測序完成時產生的時代變遷一樣，從此以后這個領域的研究水平必須站在這個基礎之上才能夠具有真正的科學價值。

當前，如果進行結核病世界先進水平的研究，必須完成的一個新的基礎工作，就是首先完成MTB全基因組規(guī)模突變體文庫的構建。突變體是結核病比較免疫學構建中必須的工具和材料。在完成MTB全基因組規(guī)?；蚯贸蛔凅w文庫構建后，通過對這些突變體在結核病免疫調控過程中的作用進行研究，就是全球結核病免疫機理研究領域的競爭核心。

支撐結核病免疫調控機理系統研究的科學實驗，需要由結核病小鼠動物模型、結核病豚鼠動物模型、結核病猴子模型三者組成。在動物模型數據框架基本構建成型的時候，結合臨床結核病免疫反應的數據，人類對于結核病免疫機理的研究、認識和利用必將達到一個全新的高度。

六、我國在結核病比較免疫學發(fā)展中的優(yōu)勢

在結核病比較免疫學大發(fā)展的歷史性過程中，我國的科研工作者是其中的重要競爭力量，必然將會做出很多重要的貢獻。這也是我國在結核病比較免疫學領域發(fā)展中已經形成的所具備的優(yōu)勢條件所決定的。

(一)我國結核病全國防控的現實需要

世界衛(wèi)生組織《2020年全球結核病報告》[40]估算，2019年全球新發(fā)結核病患者約為1000萬例，其中結核病死亡患者約為120萬例，另有20.8萬例HIV陽性結核病患者死亡。我國2019年新發(fā)結核病患者約為83.3萬例，死亡患者約為3.1萬例。

結核病在歷史上曾經是全球所有國家都要面臨的重大傳染病控制難題。隨著科學技術和經濟衛(wèi)生水平的發(fā)展，一些發(fā)達國家結核病的影響已經得到有效的控制?，F在受結核病影響嚴重的主要是第三世界經濟欠發(fā)達的國家。隨著我國經濟技術發(fā)展水平的提升和發(fā)展，在規(guī)范和普遍的結核病防控管理下，對我國結核病的現狀和形勢已經有了更加具體客觀的認識。對于結核病臨床和防控所必須的新的藥物、新的疫苗和有效公共衛(wèi)生管理措施的研究和需要，不同于其他發(fā)達國家主要由科學家研究興趣決定，這些都是由我國所面臨的結核病防控現實這一重大社會需求所決定的。

(二)不斷壯大成長的結核病科研隊伍

由于結核病臨床治療現實的需要和公共衛(wèi)生控制的需要，隨著我國結核病防控工作的持續(xù)推進和發(fā)展，在臨床和公共衛(wèi)生領域已經逐漸形成了一個相當龐大的結核病專業(yè)領域群體。從臨床診斷到臨床治療，從分子診斷到免疫診斷，從形態(tài)觀察到分子研究，在所有傳染病防控治療各個層面和水平，都已經形成一支具有相當實力的研究者隊伍。

尤其是在全球合作開放的結核病防控管理形式下，通過愈漸頻繁和深入的人員技術交流，掌握了分子生物學技術、分子遺傳學技術、現代免疫學技術的科研人員逐漸形成了一定的規(guī)模，已經逐漸具備了開展具有國際水平結核病免疫機理研究的人員技術條件。隨著我國經濟技術迅速發(fā)展和提高，正在有越來越多的研究經費來支撐廣泛而持續(xù)的結核病免疫機理的研究。

(三)全球獨有的結核病臨床數據能力

結核病免疫機理研究質變發(fā)展的標志，就是結核病比較免疫學的形成和發(fā)展。在這個承前啟后的領域劃時代發(fā)展的基礎點上，需要2個部分的數據構成。第一部分是必然的實驗研究數據，來源于可以系統控制的結核病動物模型實驗，第二部分是全面的臨床免疫數據，來源于系統全面的結核分枝桿菌感染者和結核病患者的臨床數據。

在MTB標準毒株基因突變體文庫的工具性標準病原體群的基礎上，通過對遺傳免疫特征特性不同的小鼠、豚鼠、猴子進行的系統免疫調控機理研究，結合小鼠可以純系(受試個體遺傳組成完全相同)研究的實驗，可以極大限度獲得僅僅由MTB單個基因缺失引發(fā)的宿主免疫反應變化；在此基礎上，通過已有的豚鼠和猴子系統實驗研究，將可以獲得更進一步關于MTB單個基因缺失可以引發(fā)不同遺傳免疫組成物種的宿主免疫反應變化。

我國大量的MTB感染者和結核病患者，在成為重大的公共衛(wèi)生和社會問題的同時，賦予我國真正能夠將基于結核病動物模型研究獲得的系統結核病免疫學認識轉變成對人結核病免疫機理認識的歷史性機遇。在無法對人進行MTB突變體文庫逐個基因免疫調控功能研究的情況下，我國已經擁有且可以臨床有效管理的大量的結核病患者和MTB感染者，使我國成為當前世界上唯一有能力獲得最全面、最豐富的臨床結核病免疫反應分析數據的國家。當基于當前國際水平的結核病系統動物免疫調控機理數據框架，同全球最完整和最豐富的臨床結核病免疫反應數據相結合的時候，所形成的結核病比較免疫學體系必將極大地推進結核病免疫機理研究的突破和發(fā)展。

(四)映于動物而聚于人用的學術目的

在結核病比較免疫學形成和成熟之前，雖然基于動物模型結核病研究的目的是服務于人類科學認識并解決結核病問題的，但由于不同宿主生物在免疫調控機理上的天然遺傳組成差異，這些來源于動物研究的數據和認識除了能提供一般意義的理論和參考外，很大程度上仍然不能直接反映臨床人類結核病發(fā)生的機理。

在面對MTB這種由近乎4000個編碼基因組成的復雜病原體時，由于臨床人群中被感染者和結核病患者遺傳構成上的巨大差異，不同個體出現的相關免疫反應究竟主要是由感染細菌特性決定的，還是由宿主免疫調控差異決定的，僅僅靠臨床數據的收集和觀察是完全無法進行具有循證實驗科學意義研究的，即無法通過遺傳學的可控手段直接證明其中因果關系。沒有系統結核病動物模型免疫機理研究支持的臨床免疫學數據，這樣的數據和認識就會更多地被限制在觀察和相關性認識的領域，對于疫苗和藥物研發(fā)的指導作用是間接而有限的。

基于動物模型的結核病免疫調控機理的研究，不僅是我們探索生命奧秘的理論研究，同時更是我們研究新型結核病疫苗和新型結核病控制藥物的應用需求?；谂R床結核病免疫反應的觀察和分析，不是要在臨床宿主和細菌組成復雜的借口之下將人結核病免疫機理的研究同動物模型研究獲得的進展脫離開來，而是要充分借鑒可控的遺傳學實驗，從遺傳的因果關系上獲得我們對結核病發(fā)病機理的更客觀更接近真理的認識(表1)。

(五)蓄積于循證醫(yī)學領域能力的大爆發(fā)

結核病研究領域最大的機遇包含這樣2個基本的內容。第一，是需要通過全面廣泛的臨床實踐，從實際工作中收集、梳理、發(fā)現真正的科學問題。隨著結核病臨床診斷和治療技術的發(fā)展提高，以往主要由個人經驗判斷的很多問題，已經逐漸成為可被科學技術定義和解決的內容。這里必須強調的一個問題是，由于在實驗科學中對共性技術條件的掌握和認識在實踐中必然存在差異，在面對臨床實踐中(包括各種類型的研究實驗)各種紛繁復雜的現象和問題時，一個非常關鍵的問題是如何保證我們當下發(fā)現和提出的是的確需要解決的客觀科學問題。

第二，在具備了基于循證臨床實踐篩選、發(fā)現和確定必須解決的科學問題時，以嚴密實驗科學的實證認識和技術，對相關臨床問題進行研究和解決，這是現代醫(yī)學和實驗生物學發(fā)展的共同目的和要求。通過結核病比較免疫學實驗動物數據框架逐步完善的過程，秉持客觀而邏輯實證的技術認識，在我國結核病領域培養(yǎng)鍛煉形成領域普遍的設計和應用這種技術研究的能力，將會必然地推動我國成為國際循證醫(yī)學研究實力型的國家。

七、把握機遇，引領結核病比較免疫學時代的到來

(一)牢牢把握遺傳學實驗數據支撐的技術核心

在結核病新型疫苗研究和藥物研究的過程中，全球性的瓶頸問題是對于結核病發(fā)病過程的免疫機理不夠全面、系統和深入。在MTB引發(fā)宿主免疫反應的問題上，什么樣的免疫反應是保護性的免疫反應？什么樣的免疫反應是致病性的？小鼠、豚鼠、猴子和人的結核病免疫反應是否相同？不同物種中保護性免疫反應的組成和機理是什么？這些問題對于今后臨床結核病的疫苗研發(fā)、診斷技術、藥物研發(fā)等都是無法回避的客觀難題。而研究和回答這樣的問題，就必須在國際水平的科學技術能力的基礎上，用實驗科學的手段一點一點地加以解決。

(二)掌握結核病領域實驗科學的先進技術能力

隨著國際分子生物學和分子遺傳學技術的全面突破和發(fā)展，相較于20世紀末和21世紀初，人類在生物醫(yī)學領域的研究能力已經得到極大的飛躍和提升。在結核病研究領域，在MTB基因敲除技術發(fā)明之前，對于MTB致病能力的遺傳機理研究基本為零，對于分枝桿菌基因代謝調控的分子生物學機理的研究則一直都是觀察性和描述性的，結核病動物模型的研究和發(fā)展也是非常有限的。而隨著MTB基因敲除技術的出現，以及MTB全基因組測序工作的完成，結核病相關的微生物學、遺傳學和動物實驗研究就都迅速進入到一個前所未有的分子技術時代。

表1 結核病比較免疫學的數據框架及其價值意義

在解決結核病問題的臨床和公共衛(wèi)生實踐中，能夠及時學習、理解、掌握、應用本專業(yè)領域先進的科學技術工具，是解決問題做出貢獻的根本方式。在全球結核病免疫機理研究最為激烈的競爭中，MTB基因敲除技術、結核病動物模型技術(小鼠、豚鼠和猴子)、獲得性免疫反應系統研究分析技術、功能細胞分離分析技術，都已經成為結核病免疫調控機理研究必須掌握的實驗技術。在我們日常的研究工作中不能普遍使用這些研究技術及跟上這些基本技術的發(fā)展，不能充分地理解和掌握這些基本技術的使用技能，任何人的研究工作都將無法產生具有學術和應用價值的結果，也就無法跟上這個領域的進步和發(fā)展，也就不再有機會和可能成為結核病領域具有國際水平的競爭者。

(三)全領域普及實驗科學共性的技術邏輯法則

結核病比較免疫學形成和發(fā)展中的貢獻和成就不是靠偶然的幾個人或幾個實驗就可以實現的。因為MTB的遺傳組成的復雜，4000多個編碼基因的功能認識是需要系統的動物模型實驗和其他體外生物化學、生物物理、細胞學和免疫學等多方面研究分析的，這也就必然需要很多的科研人員參與到這個領域的研究中來。雖然參與這個領域的學者眾多，領域眾多，但在每一個人的實驗中，需要遵循的實驗原則和數據標準都是相同的，其中任何科學技術邏輯和標準的錯用和缺失都會導致時間、資金和社會公共資源的極大浪費。

在結核病所有類型的動物實驗中，之所以必須設有野生型菌株的對照實驗，是因為每個單獨的突變體功能研究中的野生型MTB的對照標準，可以將不同研究的數據形成過程、數據分析、實驗結論等進行標準一致的比較、評價和分析。目前在我國進行的結核病免疫機理研究中，對于必須的先進技術的實際掌握情況來看，總體上與國際普遍水平仍然存在很大的差距。在全球結核病比較免疫學發(fā)展貢獻的這場競爭中，在結核病科研領域全面實現依賴于MTB突變體和系統動物模型的技術掌握，已經成為決定我國結核病免疫機理研究事實水平高低的關鍵。

(四)在個人成就發(fā)展中形成領域的實力主流

實踐中經常會碰到一個很普遍的問題，就是在很多正在從事結核病研究的科研工作者中，對于國際結核病領域技術現狀理解不足，對結核病領域競爭研究的熱點和重點不夠敏感。主要的表現就是一般在設計自己的實驗和研究內容時，普遍內收在對自己曾經熟悉的技術使用上，而對于當前結核病研究領域中必須掌握的領先技術則抱有習慣性的排斥和戒備心理，從而人為地壓低了自己的學術目標和能力發(fā)展。

在國內已經跨過一般研究技術和經費條件限制的情況下，科研人員如果不能掌握必要的新技術，也就必然會導致研究者始終不能跨出自己已經落后的研究水平限制。而隨著時間和研究資源的流失和浪費，這樣的科研人員被國外同行繼續(xù)拋棄和碾壓也就是其低水平實驗工作的必然結果。因此，積極而堅定地克服對新技術的畏難和恐懼情緒，主動學習和掌握領域中國際領先的實驗技術，并在研究實踐中實現自己科研能力的持續(xù)發(fā)展和提高，是所有當代我國結核病科研人員，特別是年輕科研人員能夠逐步成長，并真正成為日后全球結核病領域高水平專家的必由之路。

(五)基于結核病比較免疫學的變異調控研究新時代

當前國際上結核病免疫機理研究的技術起點就是MTB基因敲除突變體技術。由于個人專業(yè)能力、研究興趣、領域專業(yè)和預期判斷有別，尤其是全球不同國家面臨的現實需要的不同，雖然結核病免疫機理系統研究的技術準備已經成熟，但不同國家結核病研究領域的需求迫切性也是不同的。

結核病總體研究技術最全面發(fā)達的美國，由于結核病問題并不是其社會公共衛(wèi)生核心的迫切需要，所以在這個領域的研究工作主要是以科研人員個人研究興趣為主的競爭。雖然研究的技術能力和理論深度很有競爭力，但是就MTB感染中所有編碼基因在結核病免疫調控中的作用和機理，由于工作量和所需經費的巨大，短時間之內是不會形成完全覆蓋性的革命性的成果。

結核病比較免疫學的形成和發(fā)展，是結核病領域先進科學技術進步帶來的必然結果，也是我國結核病領域前所未有的歷史性機遇。在結核病臨床治療、預防和診斷現實問題巨大的社會需求壓力下，在結核病比較免疫學系統的支持下，我國結核病新型疫苗研發(fā)和結核病新型藥物研發(fā)必將會獲得前所未有的發(fā)展和提高，結核病免疫機理領域的研究將很快會進入一個全新的高速發(fā)展的時代。

免疫調控技術在臨床腫瘤治療和自體免疫性疾病治療中日益發(fā)揮重大作用的當下，借用結核病免疫機理的研究和機會，在解決結核病疫苗、治療和診斷技術需求的同時，也將允許對宿主不同的免疫反應和免疫反應調控機理進行全面而深刻的認識，從中衍生和發(fā)展出的特定免疫反應調控技術不僅將貢獻于結核病問題的解決，也為解決其他更多的臨床問題提供了無可替代的機遇和可能。

(六)機會，每個人成就的必然和偶然

作為歷史悠久的也是最成功的感染性疾病，結核病免疫機理的復雜性是醫(yī)學領域研究中眾所周知的事實。正是由于結核病免疫機理的復雜，所以在當代相關研究新技術誕生20年后的今天，全球結核病研究領域的專家在經歷了曾經公認的“關鍵基因和疫苗”期待之后，又被迫回到進行徹底全面分析研究結核病有效免疫原的這個起點上來。所以僅僅憑借既往的一些認識和猜測就想“征服”結核病的觀點和認識，必然是無法滿足人類對結核病免疫機理研究需要的。構建并完善結核病比較免疫學，并逐步細化其中的每一個精細功能實驗和分析，是人類解決結核病問題的唯一希望。

結核病比較免疫學的數據，是需要通過對MTB每一個基因突變體對宿主免疫反應調控影響的實驗來獲得的。每一個突變體，都將需要進行小鼠、豚鼠和猴子結核病模型的實驗研究，實現對小鼠結核病免疫反應機理的系統認識，實現對豚鼠結核病免疫反應機理的系統認識，實現對猴子結核病免疫反應機理的系統認識。這樣每一個全面的實驗研究結果，與臨床結核病免疫反應數據結合在一起，將形成結核病比較免疫學基本的組成數據。所以在這個過程中，每一個研究的結果都將是在最終認識和了解結核病免疫反應的機理之路上扎實前行的一步。

在全球結核病比較免疫學發(fā)展的競爭中，針對MTB每一個基因免疫調控功能的系統動物實驗，都是破解結核病終極奧妙的一次嘗試。通過這樣系統的實驗研究，將要收獲的不僅僅是科學研究成果的論文報告，收獲的更有可能是在這個領域的學術發(fā)展中做出重要甚至重大的社會貢獻。尤其重要的是，在這個全領域研究提高的過程中，掌握了結核病免疫調控機理研究先進科學技術并成長起來的眾多科研人員，必將成為未來結核病領域真正具有國際水平競爭能力的科學人才。