何 濤,李青旺,余四九

(1．甘肅農(nóng)業(yè)大學，甘肅 蘭州 730070；2．寧夏職業(yè)技術學院，寧夏 銀川 750021；3.西北農(nóng)林科技大學，陜西 楊凌 712100)

動物精液冷凍保存技術使優(yōu)秀種質資源的傳播與保存不受限制，對一些特色瀕危種質資源的保護利用具有積極意義。在生產(chǎn)實踐中，與引進活體種公畜相比，經(jīng)營者可更方便、更廉價地選擇世界最優(yōu)質的種質資源，進行人工授精與品種改良，提高生產(chǎn)效益，降低生產(chǎn)成本和患傳染病風險。精液冷凍和人工授精技術在奶牛、肉牛等大家畜中得到了廣泛的推廣應用，因豬精液冷凍保存的研究和應用相對滯后，目前仍采用鮮精或者常溫、低溫短暫保存后的鮮精配種，嚴重限制了優(yōu)良品種資源的推廣[1-2]。

精子細胞在冷凍過程中會產(chǎn)生大量的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)，過量的ROS可以和不飽和脂肪酸產(chǎn)生過氧化反應，破壞精子細胞膜，因豬精子質膜含有較多的不飽和脂肪酸，使豬精子在冷凍保存過程中易發(fā)生脂質過氧化反應產(chǎn)生過量活性氧造成其質膜完整性和通透性遭到破壞，易形成低溫打擊，導致解凍后的精子存活率低、人工授精繁殖率不高，從而限制了豬精液冷凍保存技術的廣泛推廣應用。研究表明，在稀釋液中加入外源性或內(nèi)源性抗氧化劑或者新型抗氧化劑能有效保護豬精子在保存過程受氧化損傷，保護精子并提高其活力[3-4]。黃俻華等[5]研究發(fā)現(xiàn)，冷凍稀釋液中添加600μg/m L的維生素C或E可以顯著提高陸川豬精液冷凍保存效果。黃明光等[6]研究發(fā)現(xiàn)，冷凍稀釋液中添加0.04%濃度的茶多酚可以顯著提高豬精液的凍后質量。王捷等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在豬精液冷凍稀釋液中添加 0.2 g/L芝麻酚可以顯著提高解凍后豬精子活率、SOD、CAT和GSH-Px活性。但保護效果有限，不能在生產(chǎn)實踐中直接應用，所以探尋一種新型抗氧化劑依然是豬精液冷凍保存的熱點研究課題。

綠原酸(Chlorogenic acid，CGA)是普遍存在于植物體的一種苯丙素類化合物[8]，具有抗氧化、清除活性氧自由基、抗輻射和消炎抗菌等多重作用[9-11]。研究表明，綠原酸在常溫和冷藏等條件下具有改善豬精子的存活率，提高精子線粒體活性和頂體完整率，增強其抗氧化活性，提高精液保存品質等作用[12-13]。但在冷凍條件下，有關綠原酸對豬精子保存效果的相關研究甚少。本文旨在通過在TCG稀釋液中添加不同濃度的綠原酸，測定冷凍-解凍后精子相關質量和抗氧化指標，來研究綠原酸對豬精液冷凍保存的效果，并篩選最佳添加量，為指導生產(chǎn)實踐和提高優(yōu)良種豬利用率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

隨機選取陜西省楊凌某種豬場健康青年(18～30月齡)杜洛克種公豬(n=6)，手握法采集精液，室內(nèi)顯微鏡下常規(guī)檢查，選擇色澤乳白、無異味、活力較好(0.7以上)的精液作為試驗原材料，并在 1 h內(nèi)將精液送回實驗室進行處理。

1.2 試驗儀器與試劑

液氮罐(成都金鳳)、倒置熒光相差顯微鏡(日本 Nikon)、移液槍(德國 Eppendorf)、凍精細管 0.25 mL(法國 IMV)、電子分析天平(上海精密科學)、降溫控制器(澳大利亞 Gryologic)、綠原酸(Sigma)、異硫氰熒光素酶標記的花生凝集素(Sigma)、吖啶橙(Sigma)、二水檸檬酸三鈉(國藥集團)、EDTA(國藥集團)、碳酸氫鈉(國藥集團)、TRIS(西安國安生物)、葡萄糖(Sigma)、丙三醇(Sigma)、青霉素鈉/硫酸鏈霉素(華北制藥)、SOD、CAT和GSH-Px試劑盒(南京建成生物)。

1.3 精液的預處理與稀釋

1.3.1 稀釋液配制 準確稱量葡萄糖 3.7 g，二水檸檬酸三鈉 0.6 g，EDTA 0.125 g，碳酸氫鈉 0.125 g，氯化鉀 0.008 g，青霉素鈉 0.06 g，硫酸鏈霉素 0.1 g，加雙蒸水至 100 mL，調節(jié)pH至7.28，滲透壓 310 mOsm/L配制成基礎稀釋液(BTS)；準確稱量葡萄糖 1.1 g，檸檬酸 1.48 g，Tris 2.42 g，青霉素鈉 0.06 g，硫酸鏈霉素 0.1 g，加雙蒸水至 100 mL，調節(jié)pH至6.21，滲透壓 286 mOsm/L配制成Tris-檸檬酸-葡萄糖(TCG)液；按77%的TCG液，19.4%的無菌鮮雞蛋卵黃液和3.6%的丙三醇配制成冷凍稀釋液。

1.3.2 精液的預處理 將初選合格的精液加入提前配制好的等量BTS液稀釋，用紗布包裹裝入保溫瓶中(33 ℃左右)盡快帶回實驗室，在室溫下靜置1 h，期間需要輕輕晃動精液3次，使精液與BTS液稀釋完全混勻平衡。然后分裝到 10 mL離心管中以1 000 r/min速率離心 10 min，棄上清待用。

1.3.3 精液的稀釋 首先取離心后待用的精液按1∶2比例加入等溫冷凍稀釋液并迅速用手旋轉混勻，靜置 10 min后加入不同濃度的綠原酸；然后再將稀釋靜置后加有不同濃度綠原酸的液體按1∶1比例加入等溫冷凍稀釋液并迅速用手旋轉混勻，稀釋后需繼續(xù)用紗布包裹，然后置4 ℃冰箱平衡 1.5～2 h。檢查選擇精子活力在0.6以上的稀釋精液進行裝管冷凍。

1.4 精液的冷凍和解凍

1.4.1 精液冷凍 將封裝標記好的精液細管放入程序冷凍儀中控制其以1 ℃/min的速率從4 ℃降至-5 ℃，當溫度恒定在-5 ℃時，從程序冷凍儀中迅速取出細管，快速放到冷凍槽上，使其在距液氮面 3 cm處熏蒸 10 min，最后將細管迅速投到液氮中保存。

1.4.2 精液解凍 細管凍精須在液氮中保存10 d以上、冷凍狀態(tài)穩(wěn)定后再解凍。解凍時37 ℃水浴45 s即可，取出后剪斷兩端，將精液滴入 1.5 mL離心管，再水浴 10 min后用于各項指標檢測。

1.5 精子的質量檢測

1.5.1 精子活率的檢測 解凍孵育好的精液樣品，400×倒置顯微鏡下觀察精子，根據(jù)其運動狀態(tài)評定精子活率。

1.5.2 精子質膜完整性檢測 利用低滲腫脹試驗(Hypo-osmotic Swelling Test，HOST)測定并計數(shù)，重復3次，每次計數(shù)精子不少于200個。按“精子質膜完整率=彎尾精子數(shù)/計數(shù)總精子數(shù)×100%”公式計算。

1.5.3 精子頂體完整性檢測 利用異硫氰熒光素標記的花生凝集素法(FITC-PNA)對精子頂體進行特異性染色觀測計數(shù)，重復3次，每次計數(shù)精子不少于200個。按“精子頂體完整率=頂體完整精子數(shù)/計數(shù)精子總數(shù)×100%”公式計算。

1.5.4 精子DNA完整率檢測 利用吖啶橙染色法(AOT)對精子進行特異性染色觀測計數(shù)，重復3次，每次計數(shù)精子不少于200個。按“精子DNA完整率=綠色熒光精子數(shù)/計數(shù)精子總數(shù)×100%”公式計算。

1.5.5 精子SOD活性檢測 按試劑盒說明操作并統(tǒng)計結果。

1.5.6 精子CAT活性檢測按試劑盒說明操作并統(tǒng)計結果。

1.5.7 精子GSH-Px活性檢測按試劑盒說明操作并統(tǒng)計結果。

1.6 數(shù)據(jù)處理

應用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差表示(mean values±S.E.M.)，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 綠原酸對凍后豬精子活率和功能完整性的影響

從表1可知，添加量為 15～50 μg/mL范圍時，凍后精子的活率和功能完整性指標數(shù)與添加量的呈正相關，其中添加量為 50 μg/mL時，精子活率、頂體完整率、質膜完整率、DNA完整率最高(P<0.05)。當添加劑量為 30 μg/mL時，凍后精子活率、質膜完整率和DNA完整率參數(shù)較對照組差異顯著(P<0.05)，精子頂體完整率參數(shù)較對照組差異均不顯著(P>0.05)。

表1 添加不同濃度綠原酸對豬精子活率和功能完整性的影響Table 1 The effects of chlorogenic acid on boar sperm motility and functional integrity

2.2 綠原酸對凍后豬精子抗氧化酶活性的影響

從表2試驗結果可以看出，添加綠原酸對豬精子凍后精子抗氧化物酶活性均有提高作用(P<0.05)。綠原酸添加量從 30 μg/mL到 100 μg/mL，精子SOD、CAT、GSH-Px活性均有提升(P<0.05)，其中添加量為 50 μg/mL時精子SOD、CAT、GSH-Px活性最高。當添加劑量為 15 μg/mL時，精子的SOD活性較對照組差異顯著(P<0.05)，CAT、GSH-Px活性較對照組差異不顯著(P>0.05)。

表2 添加不同濃度綠原酸對豬精子抗氧化酶活性的影響Table 2 The effects of chlorogenic acid on boar sperm antioxidant enzyme activity

圖1 相差顯微鏡下豬精子HOST檢測(200×).質膜完整精子；.質膜損傷精子Fig.1 HOST test (200×) of swine sperm under phase contrast microscope .sperm with intact plasma membrane；.sperm with impaired plasma membrane

圖2 熒光倒置顯微鏡下檢測豬精子FITC-PNA染色(400×).頂體完整精子；.頂體損傷精子Fig.1 Detection of FITC-PNA staining (400×)of swine sperm under fluorescence inverted microscope .sperm with intact acrosome；.sperm with impaired acrosome

3 討 論

本試驗結果顯示，豬精液冷凍稀釋液中添加適量綠原酸后冷凍精子活率、頂體完整率、質膜完整率、DNA完整率、SOD、CAT和GSH-Px活性等指標均有所提高，特別是添加 50 μg/mL時效果最佳，表明綠原酸對豬精液冷凍保存有一定保護作用。該結果同Namula等[14]在精子冷凍過程中添加 100 μmol/L綠原酸可改善精子活力和細胞膜完整性，提高精液保存效果的研究結果相一致。

綠原酸可能通過多方面的作用提高精子在不同條件下的保存效果。在抗氧化損傷保護方面，由于精子的質膜和細胞質富含多不飽和脂肪酸，豬精子對低溫相對比較敏感，冷凍過程中精子獲能和運動時容易發(fā)生線粒體功能障礙，引起供能(ATP)不足。另外線粒體生成過量的ROS，與精子質膜和細胞質中的不飽和脂肪酸產(chǎn)生過氧化反應導致膜損傷，使精子功能改變，造成精液品質下降[15]。綠原酸作為多酚類化合物，其分子中含有5個活性羥基和1個羧基，能提供氫自由基來有效消除活性氧和羥基自由基，從而避免發(fā)生氧化反應，有效減少精子的氧化損傷，維持精子結構和功能完整性[16]；另一方面綠原酸的抗氧化性可能通過清除氫、氧自由基和調節(jié)糖代謝來實現(xiàn)[17]。精液中SOD、CAT和GSH-Px酶活性可直接反映其抗氧化能力，其活性越高說明其抗氧化性越強。添加綠原酸后精子抗氧化酶的活性都顯著提升，這說明抗氧化能力的升高是潛在的作用途徑之一。這也可以通過Feng等[18]和Boettler等[19]分別發(fā)現(xiàn)綠原酸通過谷胱甘肽等途徑上調抗氧化酶活性的研究結果得以體現(xiàn)。

在抗低溫打擊方面，由于豬精液在冷凍保存過程中，比其他家畜更容易受低溫打擊發(fā)生冷休克和因溫度的改變而形成的細胞內(nèi)冰晶會損傷細胞膜、線粒體和核結構，進而造成細胞不可逆的損傷，主要表現(xiàn)在解凍后精子活力降低或喪失，頂體膜受損，DNA完整率下降等，一般精子在低溫或冷凍保存時加入一定的抗凍保護劑，如滲透性冷凍保護劑甘油、二甲基乙酰胺(DMA)、乙二醇、二甲基亞砜(DMSO)等以及非滲透性冷凍保護劑卵黃和糖類等來減少冷應激對精子造成的損傷[20]。本試驗在豬精液冷凍保存時加入綠原酸，可能減少了細胞內(nèi)外溶液形成的大個體冰晶，促使精子能夠安全通過冰晶化危險溫度區(qū)，降低低溫對精子細胞膜、頂體的破壞，從而顯著的提高精子活率、頂體完整率、質膜完整率，減少了低溫對精子的物理損傷，這說明抗低溫打擊能力的提高是潛在的作用途徑之一。這同Ros-Santaella等[21]在豬精液保存過程中添加含有綠原酸的龍須草提取物等方法提高精子的直線運動率和細胞膜完整率的研究研究結果一致。

本試驗中綠原酸對精子的冷凍保護效果，并沒隨著添加劑量的增加而逐漸增強，添加量達到 100 μg/mL時，凍后精子各項檢測指標反而均有所下降，特別是活率下降明顯，這可能與過量添加綠原酸會降低精液樣品pH和冷凍稀釋液的滲透性有關[22]。pH過低影響琥珀酰輔酶A、乙酰輔酶A等代謝酶的?；饔?，降低這些酶介導的能量代謝，使精子的代謝能力和運動性能逐漸減弱影響ATP水平，降低精子活性劑保存效果。新鮮豬精液的滲透壓為 290～300 mOsm，pH約為7.2～7.5[23]，當精液pH降低至6.2時，兩天后精子質膜完整性和保存活率均出現(xiàn)顯著的降低[24]，pH為6.5～6.9時常溫保存的效果最好[25]，所以當精液滲透壓超過一定范圍，精子會出現(xiàn)脫水、腫脹等現(xiàn)象發(fā)生不同程度的損傷，降低精液的品質。在本研究中，50 μg/mL綠原酸添加對冷凍精子的保護效果最佳，可能同該添加濃度下精液pH和滲透壓最適宜相關，也說明研究其他精液冷凍保護劑時需要仔細考慮不同劑量對上述因素的影響。

4 結 論

豬精液冷凍稀釋液中添加綠原酸可通過提高凍后精子活率、頂體完整率、質膜完整率、DNA完整率、SOD、CAT和GSH-Px活性等來起到保護作用，最適添加量為 50 μg/mL。