杜帥琳 王 玉 張 玲 萬海同

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）是由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起，具有潛伏期長、感染性強(qiáng)、傳播范圍廣的特點(diǎn)［1］。COVID-19可通過飛沫傳播和密切接觸傳播，各類人群均易感，感染后會出現(xiàn)乏力、干咳和發(fā)熱的現(xiàn)象，嚴(yán)重者會引起急性呼吸衰竭、腎功能衰竭，甚至死亡［1-3］。截至北京時間2020年3月15日24時，全球共127個國家和地區(qū)報告COVID-19，其中，中國累計報告確診80 860例，死亡3 213例；其他國家累計確診61 518例，死亡2 199例。目前韓國、意大利、伊朗疫情持續(xù)嚴(yán)峻，根據(jù)目前形勢，COVID-19有轉(zhuǎn)成慢性疾病的可能，與人類共存。COVID-19尚無特效藥，推薦使用的化學(xué)藥如阿比多爾等可能導(dǎo)致惡心、腹瀉、頭暈、血清轉(zhuǎn)氨酶增高等不良反應(yīng)［4］，目前臨床中主要是中西醫(yī)結(jié)合對癥治療。中醫(yī)的整體觀念與辨證論治特點(diǎn)在COVID-19治療中凸顯出優(yōu)勢，因此從現(xiàn)有有效中醫(yī)方劑中篩選抗SARS-CoV-2的活性化合物，對提高COVID-19的治療效果具有重要意義。

散寒化濕宣肺方（SHXF）為《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》推薦用藥，適用于COVID-19普通型患者的臨床治療［5］，癥見低熱、身熱不揚(yáng)、干咳、少痰、胸悶、脘痞等。該方由蒼術(shù)、陳皮、厚樸、藿香、草果、生麻黃、羌活、生姜、檳榔組成，具有外散寒邪、宣肺祛濕的功效。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)［6］強(qiáng)調(diào)從生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度來分析藥物所含的各種活性成分作用于機(jī)體的多個位點(diǎn)及其產(chǎn)生作用的一系列途徑，相較于傳統(tǒng)藥理學(xué)更注重整體性和系統(tǒng)性，符合中醫(yī)整體觀念。分子對接是利用計算機(jī)技術(shù)模擬分析受體的特征以及受體和藥物分子間的相互作用關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)配體與受體活性位點(diǎn)低能結(jié)合的較為成熟的藥物設(shè)計技術(shù)［7］。本研究旨在討論SHXF所含活性化合物及其作用靶點(diǎn)，并將該方核心化合物與抗新型冠狀病毒靶向蛋白SARSCoV-2 3CL水解酶和Nsp15進(jìn)行分子對接，以期篩選SHXF抗SARS-CoV-2的活性化合物，提高臨床療效。

1 資料與方法

1.1 方劑中藥化合物與靶點(diǎn)的收集及標(biāo)準(zhǔn)化處理在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺數(shù)據(jù)庫TCMSP［8］（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索SHXF中所含化合物及其標(biāo)靶蛋白，根據(jù)藥代動力學(xué)（ADME）設(shè)定口服生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18），篩選獲得待分析化合物。在BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）設(shè)置條件為score≥20，P＜0.5收集篩選出的備用化合物靶點(diǎn)，剔除非人源靶點(diǎn)。整理所得靶點(diǎn)，刪除重復(fù)項(xiàng)，獲得待處理靶點(diǎn)。將TCMSP數(shù)據(jù)庫所預(yù)測標(biāo)靶蛋白運(yùn)用R語言轉(zhuǎn)化為基因名稱，整合來自BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)，經(jīng)UniProt［9］（https：//www.uniprot.org/）和 GeneCards［10］（https：//www.genecards.org/）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，形成數(shù)據(jù)集。

1.2 “藥材-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將化合物-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集導(dǎo)入網(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape3.7.1中，進(jìn)行可視化，繪制“藥材-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。分析運(yùn)用“Network Analyze”插件分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，計算節(jié)點(diǎn)度值（Degree）、介度中心性（Betweenness Centrality）及緊密度中心性（Closeness Centrality）的中位數(shù)，選取大于3個特值中位數(shù)的化合物和靶點(diǎn)作為關(guān)鍵化合物與靶點(diǎn)。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將關(guān)鍵蛋白標(biāo)靶導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）得到蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖（PPI），再將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件中，進(jìn)行可視化，分析蛋白質(zhì)之間的作用關(guān)系。

1.4 靶點(diǎn)的基因富集與通路富集分析 將上述關(guān)鍵標(biāo)靶蛋白導(dǎo)入 DAVID［11］數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp），條件選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”；“Gene list”；Homo sapiens（Human）。分別在生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞組件（CC）和分子功能（MF）和對預(yù)測靶點(diǎn)的基因及其產(chǎn)物進(jìn)行功能定義分析。進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號通路富集分析，限定物種為“Human”，篩選校正后P＜0.05的結(jié)果作為SHXF化合物標(biāo)靶蛋白的作用機(jī)制。

1.5 成分-靶點(diǎn)分子對接 從PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫下載SHXF關(guān)鍵化合物的3D結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入PyMOL軟件。從PDB［12］（https：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫下載SARS-CoV-2 3CL水解酶（PDB ID：6LU7）和 Nsp15（PDB ID：6VWW）的結(jié)構(gòu)，PyMOL軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行去水、加氫等操作，利用AutoDockVina軟件進(jìn)行對接并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 SHXF活性化合物與靶點(diǎn) 在TCMSP數(shù)據(jù)庫共檢索得到SHXF活性化合物85個，其中蒼術(shù)9個、陳皮5個、厚樸2個、藿香11個、草果8個、麻黃23個、羌活14個、生姜5個、檳榔8個（見表1）。經(jīng)篩選總共獲取214個作用靶點(diǎn)。所得化合物和靶點(diǎn)中有20.63%的化合物作用靶點(diǎn)≥10，其中9個化合物作用靶點(diǎn)多于20個，同時也存在多種化合物共同作用于1個靶點(diǎn)的現(xiàn)象，這也證明了中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)的特性。

2.2 “藥材-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖 藥材-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖共包括277個節(jié)點(diǎn)（63個化合物節(jié)點(diǎn)、214個靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和2 096條邊（見圖1）。其中MOL000098-槲皮素為藿香、草果、生麻黃的共有化合物，MOL004328-柚皮素為陳皮、生麻黃共有化合物，MOL000358-β-谷甾醇為生麻黃、羌活、生姜共有化合物。經(jīng)拓?fù)浞治龉搏@取19個關(guān)鍵化合物，74個關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中排名前5的化合物為MOL000098-槲皮素、MOL000358-β-谷甾醇、MOL004328-柚皮素、MOL000449-豆甾醇、MOL000422-山奈酚，分別能與135、26、31、26、63個靶點(diǎn)蛋白發(fā)生相互作用。

表1 SHXF中部分活性化合物

圖1 SHXF“藥材-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將74個關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入String網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建平臺，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)Cytoscape3.7.1軟件可視化共得到68個節(jié)點(diǎn)，2 902條邊（見圖2）。節(jié)點(diǎn)越大，說明度值越高，靶點(diǎn)所參與的生物過程越多；邊越粗、顏色越深說明標(biāo)靶蛋白之間的相互作用越強(qiáng)，聯(lián)系越高。其中Akt1、IL-6、MAPK3、VEGFA、JUN等度值最大，說明其參與的生物活動最多（見表2）。

2.4 靶點(diǎn)通路分析 經(jīng)GO富集分析共得到599條GO信息（P＜0.05），其中GO-BP 460個條目，GO-CC 55個條目，GO-MF 84個條目（見圖3）。KEGG通路富集分析共得到113條通路（P＜0.05），其中涉及甲型流感（Influenza A）信號通路、TLR信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路等，選取前20條作氣泡圖（見圖4）。

圖2 蛋白質(zhì)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 靶點(diǎn)信息表

圖3 GO分析圖

2.5 SHXF核心活性化合物與SARS-CoV-2 3CL水解酶和Nsp15蛋白的分子對接結(jié)果 一般認(rèn)為配體與受體對接的結(jié)合能越低，發(fā)生作用的可能性越大，本研究以結(jié)合能≤5.0 kacl/mol為篩選標(biāo)準(zhǔn)［13］。分子對接結(jié)果顯示SHXF中槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇等與SARS-CoV-2 3CL水解酶和Nsp15蛋白有較好結(jié)合，說明其可能在COVID-19的治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用（見表3，圖5）。

3 討 論

盡管目前在《新型冠狀肺炎病毒診療方案（第七版）》中有瑞德西韋、阿比多爾等抗病毒藥物用于臨床治療，但對于COVID-19的治療仍無特效藥。在此次疫情防治工作中，中醫(yī)藥顯示出了其獨(dú)特優(yōu)勢，本研究方劑SHXF為國家抗疫推薦藥方。

圖5 槲皮素、β-谷甾醇與SARS-CoV-2 3CL和Nsp15蛋白的分子對接模式圖

本研究中獲得的SHXF作用靶點(diǎn)的生物學(xué)功能主要涉及血管生成、脂多糖介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、缺氧反應(yīng)等多個生物學(xué)過程，涉及的靶點(diǎn)包括IL-6、IL-10、CAV1、VEGFA、Akt1等。其中VEGFA為血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的一種，是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生。有研究指出，VEGF能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生、纖維化，促使單核細(xì)胞趨化積聚引發(fā)炎癥反應(yīng)［14］，從而加重病情，表明VEGF可能為引起肺炎患者肺組織血管發(fā)生病變的原因。

KEGG富集共得到113條結(jié)果，主要涉及甲型流感（Influenza A）信號通路、TLR信號通路、PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路等。TLR信號通路的Toll樣受體是細(xì)胞膜糖蛋白，在早期宿主防御病毒入侵過程中發(fā)揮重要作用［15］。病毒感染通過激活多種模式識別受體（PRRS）以誘發(fā)的抗病毒反應(yīng)，如激活TLRs等，在甲型流感病毒感染期間，通過TLR7/8識別病毒ssRNA，TLR3課識別病毒dsRNA，在早期抗病毒反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用［16］。PI3K-Akt信號通路的PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。現(xiàn)已報道有許多病毒可誘導(dǎo)PI3K途徑，如SARS冠狀病毒、流感病毒、EB病毒、乙型肝炎病毒等，它們都能利用PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為自身的復(fù)制增殖提供有利條件［17］?；罨蟮腜I3KAkt通路不僅參與高效的病毒復(fù)制和傳播，還可以調(diào)節(jié)抗病毒的功能［18］。HIF-1信號通路由缺氧誘導(dǎo)因子-1誘導(dǎo)激活，可能與COVID-19患者普遍存在缺氧、呼吸困難的病理表現(xiàn)有相關(guān)性。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度對SHXF的化合物、作用靶點(diǎn)、作用通路以及藥方中的活性成分與SARSCoV-2 3CL水解酶和Nsp15蛋白對接的結(jié)合能進(jìn)行了探索性研究。結(jié)果提示SHXF可能通過TLR信號通路、PI3K-Akt信號通路等起到治療COVID-19的作用。同時，本研究基于分子對接技術(shù)，對SHXF中主要活性物質(zhì)與SARS-CoV-2 3CL水解酶及Nsp15進(jìn)行分子對接，發(fā)現(xiàn)SHXF中槲皮素、β-谷甾醇等Vina結(jié)合能與西藥瑞德西韋相當(dāng)或更好，為臨床篩選治療COVID-19的有效中藥提供了思路。但本研究主要依托數(shù)據(jù)庫，通過數(shù)據(jù)挖掘?qū)χ兴幍墓δ茏饔眠M(jìn)行預(yù)測，還需在試驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。