崔杰 耿利民

肺癌是全球癌癥死亡的重要原因，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康[1-2]。肺癌的發(fā)生與發(fā)展是一個多因素、多階段和多基因調(diào)控的復(fù)雜過程，其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚不完全清楚。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類由17-25個核苷酸組成的非編碼RNA，可調(diào)控人類約30%基因，與腫瘤的發(fā)展發(fā)展密切相關(guān)[3]。既往研究[4-5]顯示，miRNA可通過與相關(guān)靶基因3’非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’UTR)特異性結(jié)合影響細(xì)胞功能在肺癌中發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用。越來越多的研究[6-8]顯示，miR-190在結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌等多種腫瘤組織中異常表達(dá)，且可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有學(xué)者[9-10]指出，miR-190在肺癌中表達(dá)上調(diào)，且與患者預(yù)后密切相關(guān)，但其在肺癌中的作用并不清楚。本研究旨在探討miR-190低表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響及其機(jī)制，以期為肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及治療提供新線索。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

人肺癌細(xì)胞株A549(中科院上海細(xì)胞庫)，miR-190模擬物、miR-190抑制劑及其陰性對照(廣州銳博生物公司)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和青鏈霉素(美國Hyclone公司)，胰蛋白酶(北京鼎國生物公司)，脂質(zhì)體2000(美國Invitrogen公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(碧云天生物公司)，Trizol試劑(康為世紀(jì)生物公司)，兔抗人生長分化因子11(growth differentiation factor 11，GDF11)和β肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(美國Abcam公司)，噻唑藍(lán)(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)試劑和二甲基亞砜(美國Sigma公司)，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(美國默克生物公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Life Technologies Corp公司)，熒光素酶報告基因檢測試劑盒和膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京博邁斯科技公司)，psiCHECK-2熒光素酶載體(西安賽拓博泰生物)。Transwell小室和流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Heraeus公司)，多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)，倒置顯微鏡(美國OLYMPUS CK40公司)，熒光定量PCR儀(美國Life Technologies公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

二、細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染

使用含100 U/mL青鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2常規(guī)條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549細(xì)胞。將指數(shù)期的A549細(xì)胞以每孔3×105個接種至6孔細(xì)胞板上，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜。實(shí)驗(yàn)分為對照(Ctrl)組、抑制劑陰性對照(anti-miR-NC)組和miR-190抑制劑(anti-miR-190)組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。待細(xì)胞培養(yǎng)至70%匯合度時，參照脂質(zhì)體2000說明書步驟將miR-190抑制劑/抑制劑陰性對照根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組加入到A549細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染5h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集各組細(xì)胞并采用實(shí)時熒光定量PCR儀檢測細(xì)胞中miR-190的表達(dá)水平以評價轉(zhuǎn)染效果。

三、實(shí)時熒光定量PCR檢測細(xì)胞中miR-190的表達(dá)

采用Trizol法提取A549細(xì)胞的總RNA后，使用紫外分光光度計(jì)檢測RNA的濃度與純度。再參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為模板，根據(jù)上海生工生物合成的引物(miR-190 F:5’-GGGTGATATGTTTGATATATTAGG-3’,R:5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’;U6 F:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,R:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’)按照PCR反應(yīng)條件(94℃ 300s，94℃ 30s、58℃ 30s，共38個循環(huán))進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以U6作內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算A549細(xì)胞中miR-190的表達(dá)水平。重復(fù)3次。

四、MTT法檢測細(xì)胞增殖

將指數(shù)期A549細(xì)胞以每孔3×104個接種至96孔細(xì)胞板上后，將其按照1.2中進(jìn)行分組并轉(zhuǎn)染。分別轉(zhuǎn)染12 h、24 h、48 h和72 h后棄培養(yǎng)液，加入濃度為5g/L的MTT試劑20μL/孔，孵育4 h后，再加入二甲基亞砜震蕩10 min。采用多功能酶標(biāo)儀在492 nm波長處檢測各組細(xì)胞的光密度值。重復(fù)3次。

五、Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲

胰蛋白酶消化收集轉(zhuǎn)染48 h后的anti-miR-NC組、anti-miR-190組及未轉(zhuǎn)染的Ctrl組細(xì)胞后，使用無血清的DMEM培養(yǎng)基制備濃度為105個/mL的細(xì)胞懸液。在鋪于基質(zhì)膠的Transwell小室的上室中加入細(xì)胞懸液300μL，同時下室中加入含血清的DMEM培養(yǎng)基800 μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。使用磷酸緩沖液對取出的Transell小室洗滌后，以4%甲醛固定細(xì)胞25 min，再以0.1%結(jié)晶紫染色15 min。洗去染色液后，放于倒置顯微鏡下觀察拍照并統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)，結(jié)果以隨機(jī)選取3個高倍視野(200×)內(nèi)細(xì)胞數(shù)的均值表示。重復(fù)3次。

六、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

收集轉(zhuǎn)染48h后的anti-miR-NC組、anti-miR-190組及未轉(zhuǎn)染的Ctrl組細(xì)胞，使用磷酸緩沖液洗滌后，加入500μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。先后加入 Annexin-V-FITC和PI 各5 μL后，室溫下避光反應(yīng)10 min。使用流式細(xì)胞儀在60 min內(nèi)檢測各組細(xì)胞的凋亡率。重復(fù)3次。

七、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測miR-190和GDF11的靶向關(guān)系

生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)GDF11 3’UTR區(qū)與miR-190存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，將克隆擴(kuò)增GDF11的3’UTR片段重組至psiCHECK-2熒光素酶載體上，作為GDF11野生型(GDF11-WT)報告基因載體；另外，將miR-190與GDF11 3’UTR結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變后重組至psiCHECK-2熒光素酶載體上，作為GDF11突變型(GDF11-MUT)報告基因載體。參照脂質(zhì)體2000說明書步驟將構(gòu)建的GDF11-WT和GDF11-MUT載體分別與miR-190模擬物/抑制劑、模擬物/抑制劑陰性對照共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，分別標(biāo)記為GDF11-WT+miR-190/anti-miR-190組、GDF11-WT+miR-NC/anti-miR-NC組、GDF11-MUT+miR-190/anti-miR-190組、GDF11-MUT+miR-NC/anti-miR-NC組。轉(zhuǎn)染48 h后參照熒光素酶檢測試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

八、免疫印跡法檢測細(xì)胞中GDF11蛋白的表達(dá)

將指數(shù)期的A549細(xì)胞以每孔105個接種至6孔細(xì)胞板上后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞分為miR-190模擬物(miR-190)組、模擬物陰性對照(miR-NC)組、anti-miR-190組和anti-miR-NC組，其中每組3個復(fù)孔。參照脂質(zhì)體2000說明書步驟根據(jù)上述分組將miR-190模擬物/抑制劑及模擬物/抑制劑陰性對照轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并采用BCA法檢測總蛋白的濃度。將蛋白樣品與等體積上樣緩沖液混勻后，在沸水浴中煮沸5 min。將變性后的蛋白樣品加入到十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。待電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯上。以5%脫脂奶粉封膜2 h后，加入1 ∶1 000比例稀釋的GDF11和β-actin抗體并在4℃下孵育24 h。棄一抗后，再以1 ∶2 000比例稀釋的二抗室溫孵育1.5 h。經(jīng)化學(xué)發(fā)光劑顯影曝光后，以β-actin為內(nèi)參，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各組細(xì)胞中GDF11蛋白的表達(dá)水平。重復(fù)3次。

九、數(shù)據(jù)分析

結(jié) 果

一、轉(zhuǎn)染后肺癌A549細(xì)胞中miR-190表達(dá)

實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果表1顯示，在轉(zhuǎn)染miR-190抑制劑陰性對照的anti-miR-NC組中miR-190的表達(dá)水平與Ctrl組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但在轉(zhuǎn)染miR-190抑制劑的anti-miR-190組中miR-190的表達(dá)水平較Ctrl組明顯降低(P<0.05)(見表1)。

表1 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中miR-190表達(dá)水平

二、miR-190低表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測結(jié)果表2顯示，轉(zhuǎn)染12 h～72 h后anti-miR-NC組細(xì)胞的增殖活力與Ctrl組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但轉(zhuǎn)染24 h～72 h后anti-miR-190組細(xì)胞的增殖活力較Ctrl組明顯降低(P<0.05)(見表2)。

表2 轉(zhuǎn)染不同時間后各組細(xì)胞光密度值的比較

三、miR-190低表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞侵襲的影響

Transwell小室檢測結(jié)果圖1和表3所示，與Ctrl組比較，anti-miR-190組中侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，但anti-miR-NC組與Ctrl組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3,圖1)。

表3 各組中侵襲細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞凋亡率的比較

圖1 Transwell小室檢測各組細(xì)胞侵襲結(jié)果(×200)

四、miR-190低表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果圖2和表3所示，anti-miR-NC組細(xì)胞凋亡率與Ctrl組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但anti-miR-190組細(xì)胞凋亡率較Ctrl組明顯升高(P<0.05)(見表3,圖2)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡結(jié)果

圖3 miR-190和GDF11的關(guān)系分析

五、miR-190靶基因的預(yù)測及其驗(yàn)證

TargetScan生物學(xué)信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果圖3A所示，GDF11 3′ UTR與miR-190存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測結(jié)果表4所示，與相應(yīng)對照miR-NC和anti-miR-NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-190模擬物可明顯降低GDF11-WT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞熒光素酶活性，而轉(zhuǎn)染miR-190抑制劑可明顯升高其熒光素酶活性(P<0.05)；但轉(zhuǎn)染miR-190模擬物或miR-190抑制劑后GDF11-MUT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞的熒光素酶活性與相應(yīng)對照比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時，免疫印跡法檢測結(jié)果圖3B和表4所示，轉(zhuǎn)染miR-190模擬物可明顯抑制A549細(xì)胞中GDF11蛋白的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-190抑制劑則明顯促進(jìn)GDF11蛋白的表達(dá)(P<0.05)(見表4，圖3 A、B)。

表4 各組細(xì)胞熒光素酶活性和GDF11蛋白表達(dá)水平的比較

討 論

肺癌是常見的呼吸系統(tǒng)腫瘤，由于其發(fā)病隱匿的特性，多數(shù)患者就診時已為晚期，錯失了根治性手術(shù)治療的最佳時期，患者在5年內(nèi)的生存率只有15%左右[1,11]。因此，深入探討肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尋找新的、有效的治療靶點(diǎn)十分必要。

miR-190是一條高度保守的miRNA，位于15號染色體的talin2基因的內(nèi)含子區(qū)域；其在不同腫瘤中呈現(xiàn)不同表達(dá)，且發(fā)揮著不同的作用。例如：miR-190在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，不僅可通過調(diào)控TGF-β誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著抑制作用[12]，還可通過靶向Sry相關(guān)高泳動類非組蛋白基因9(Sry-related high mobility group-box gene 9，SOX9)抑制Wnt /β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號傳導(dǎo)提高抗雌激素敏感性[13]；miR-190在膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)，且可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡發(fā)揮抑癌作用[14]；然而，miR-190在肝癌中表達(dá)上調(diào)[15]，可通過靶向抑制PH結(jié)構(gòu)域且富含亮氨酸重復(fù)基序的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶1(pleckstrin homology domain leucine-rich repeat protein phosphatase 1，PHLPP1)的表達(dá)在癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用[16]。盡管已有學(xué)者[9-10]指出，miR-190在肺癌中表達(dá)上調(diào)，但其發(fā)揮的作用并不清楚。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-190抑制劑成功下調(diào)miR-190表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，肺癌A549細(xì)胞的增殖活力和侵襲能力明顯減弱，同時細(xì)胞凋亡能力明顯增強(qiáng)。結(jié)果表明，miR-190低表達(dá)可抑制肺癌A549細(xì)胞增殖、侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這提示miR-190可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。

GDF11是轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)超家族成員，在胚胎正常發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。研究顯示，GDF11在肝癌和食管癌等中異常表達(dá)，且可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡等發(fā)揮著重要的抑癌作用[17-18]。已有研究[19-20]指出，GDF11低表達(dá)與肺癌患者的惡性程度高有關(guān)，且外源表達(dá)GDF11后可通過p53、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子1(glucose transporter type1，GLUT1)、 B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotease，MMP-2)等蛋白抑制細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究進(jìn)一步對miR-190的靶基因進(jìn)行預(yù)測，結(jié)合相關(guān)資料，最終將GDF11作為研究對象。生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)GDF11 3’UTR區(qū)域與miR-190存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，同時采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-190可與GDF11 3’UTR靶向結(jié)合；免疫印跡法進(jìn)一步檢測證實(shí)miR-190可負(fù)向調(diào)控GDF11蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，GDF11是miR-190的靶基因。這提示，miR-190調(diào)控肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡可能與靶向調(diào)控GDF11表達(dá)有關(guān)。

總之，miR-190低表達(dá)可抑制肺癌A549細(xì)胞增殖與侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與靶向調(diào)控GDF11表達(dá)有關(guān)。該結(jié)果豐富了肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，也為肺癌的治療提供了新線索。