陳宇，陽航，路艷霞，周晨溪，閆夢瑩，李路軍,2,3，胡澤華

(1.藥物高通量篩選國家與地方聯(lián)合工程研究中心， 中藥生物技術湖北省重點實驗室， 湖北大學， 湖北 武漢 430062；2.甘肅百草中藥材種植有限公司， 甘肅 蘭州 7301024；3.深圳市老年醫(yī)學研究所， 深圳 518020；4.湖北民族大學醫(yī)學院， 湖北 恩施 445000)

0 引言

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以關節(jié)滑膜炎癥為主要表現(xiàn)的系統(tǒng)自身免疫性疾病,以對稱性多關節(jié)炎、慢性炎癥為主要臨床表現(xiàn)[1]. RA中滑膜組織的改變最為顯著，滑膜成纖維細胞是關節(jié)滑膜最活躍的組成細胞，它在RA的發(fā)病、慢性炎癥的維持、骨與軟骨的破壞等方面具有重要的作用[2]，異常增生的滑膜成纖維樣細胞分泌基質(zhì)蛋白酶和致炎細胞因子，促發(fā)炎癥和免疫反應，是導致軟骨和骨質(zhì)破壞的主要因素[3]，因此抑制RA滑膜成纖維細胞的增生及炎癥是治療類風濕關節(jié)炎的重要策略.

華中枸骨葉為冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬(Ilex)植物華中枸骨(I.centrochinensis)的干燥葉，具有清熱解毒、祛風除濕作用，在湖北恩施土家族地區(qū)常用于治療RA，具有豐富的民族民間用藥經(jīng)驗[4]. 林立冬等[5]從華中枸骨葉中分離鑒定出柚皮素等多個黃酮類化合物. 本研究室前期研究證實其醇提物具有很強的抗炎和自由基清除作用[6]，并先后從中分離得到多個具有明顯抗炎活性的黃酮類成分[7-11]，提示黃酮類成分可能為其主要抗RA活性物質(zhì). 為深入開發(fā)利用該民族藥物，本研究對華中枸骨葉總黃酮(ICTF)進行富集純化，并以TNF-α誘導的人關節(jié)滑膜成纖維細胞體外評價其抗RA關節(jié)滑膜炎癥活性，旨在為開發(fā)以ICTF為主的藥品及功能食品提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器華中枸骨葉，2015年6月采自湖北省恩施州建始縣，原植物經(jīng)湖北民族大學醫(yī)學院郜紅利教授鑒定為華中枸骨Ilexcentrochinensis的葉，樣品標本(No. IC-20150615)保留在湖北大學中藥生物技術湖北省重點實驗室. 人關節(jié)滑膜成纖維細胞MH7A由重慶醫(yī)科大學朱深銀老師饋贈.

槲皮素對照品(批號10081-9905，中國藥品生物制品檢定所)；D101、D101-1、DA201、DS401、DM301大孔吸附樹脂(天津市海光化工有限公司)；乙醇、甲醇(天津市富宇精細化工有限公司)；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、石油醚、乙酸乙酯(國藥集團化學試劑有限公司，各試劑均為分析純)；高糖DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(澳洲Gibco公司)；雙抗、胰蛋白酶(吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司)；腫瘤壞死因子TNF-α、二甲基亞砜DMSO和噻唑藍MTT(Sigma公司)；NO檢測試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；吲哚美辛腸溶片(山西太原藥業(yè)有限公司)；TRIZOL(Invitrogen生物科技公司)；逆轉錄試劑盒、SYBR Green熒光定量試劑盒(上海東洋紡生物科技有限公司).

紫外分光光度計UV-1500 PC型(上海美析儀器有限公司)；SF400 A電子天平(上海晶安生物科技有限公司)；旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；細胞培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；超凈工作臺(中國蘇州安泰空氣技術有限公司)；BIO-RAD iMARKTM酶標儀、My CyclerTM Thermal、BIO-RAD CFX ConnectTM Real-Time System(美國BIO-RAD公司)；Imager2000凝膠成像分析儀(美國Alpha-Innotech公司)；水平電泳槽DYY-6C(北京市六一儀器廠).

1.2 華中枸骨總黃酮提取純化

1.2.1 標準曲線制備 精密稱取槲皮素對照品0.002 5 g和華中枸骨葉總黃酮適量，溶解后80%乙醇定容于50 mL容量瓶. 分別取槲皮素對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL和總黃酮溶液適量，各自置于10 mL容量瓶，加入0.4 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min；再加入0.4 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min；最后加入4 mL 4% NaOH溶液，搖勻，用80%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻靜置15 min. 以相應試劑作為空白，在波長200～800 nm進行波長掃描. 選擇測定波長. 以A值為縱坐標，質(zhì)量濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，根據(jù)A值計算樣品中總黃酮的量，并按下式計算每一步純化后總黃酮含量和轉移率. 總黃酮含量=總黃酮量/固形物量；轉移率=處理后總黃酮量/處理前總黃酮量.

1.2.2 總黃酮的提取 取華中枸骨葉10.0 kg，適當粉碎，80% 的乙醇40 L冷浸提取3次，每次48 h，合并提取液并干燥，得乙醇總提取物862 g. 計算總提取物中總黃酮含量.

1.2.3 堿溶酸沉法 準確稱取華中枸骨葉乙醇總提取物干燥粉末5.00 g，用蒸餾水分散，加入適量5% NaOH至pH=8～9，水浴保持12 h，抽濾合并濾液；再用濃鹽酸將濾液調(diào)至pH=3～4，靜置24 h，抽濾，合并沉淀；用水將沉淀物洗至中性，干燥后得總黃酮粗粉，試驗平行進行3次. 計算總黃酮含量以及轉移率.

1.2.4 石油醚脫脂法 稱取上步總黃酮提取物5.00 g，以蒸餾水充分分散，置于250 mL分液漏斗中，以等量的石油醚萃取3次，棄石油醚層，將水層干燥，得總黃酮干燥粗粉. 3次平行試驗后測定并計算其總黃酮含量及轉移率.

1.2.5 聚酰胺吸附法 取經(jīng)石油醚脫脂所得的總黃酮干燥粗粉5.00 g，用多量的水分散溶解，聚酰胺柱色譜吸附，分別用30%、50%、95%乙醇溶液洗脫至近無色，收集洗脫液. 試驗平行進行3次，測定并計算總黃酮含量以及轉移率.

1.2.6 大孔吸附樹脂法 大孔吸附樹脂的選擇：準確稱取預處理好的D101、D101-1、DS401、DA201、DM301大孔吸附樹脂各250 g，裝入色譜柱中(柱體積約300 mL，徑高比為1∶8). 取經(jīng)石油醚脫脂所得的總黃酮干燥粗粉5.00 g，用蒸餾水充分溶解，大孔吸附樹脂柱色譜反復吸附，分別用適量30%、50%、95%乙醇洗脫至近無色，收集洗脫液干燥，測定并計算總黃酮含量及轉移率. 每種樹脂分別進行3次平行試驗.

洗脫劑用量考察：準確稱取預處理好的D101大孔吸附樹脂250 g，濕法裝柱，取純化得到的總黃酮干燥粗粉5.00 g，用蒸餾水混懸后，D101樹脂柱色譜吸附，用50%的乙醇進行洗脫，按柱保留體積分段收集洗脫液，測定洗脫液中總黃酮的量，計算其收率，以總黃酮收率對洗脫體積繪制洗脫曲線，考察洗脫劑用量.

1.2.7 葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜法 取上步經(jīng)大孔樹脂純化所得的總黃酮干粉0.50 g，用適量水溶解，經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20色譜柱，甲醇進行洗脫，以1/2柱體積為1個流分收集并依次進行編號，進行鹽酸鎂粉反應，待反應呈陰性時停止收集，合并甲醇洗脫液，濃縮后真空干燥得干燥粉末，測定并計算總黃酮含量以及轉移率.

1.2.8 驗證實驗 準確稱取華中枸骨葉乙醇提取物84 g，以適量蒸餾水充分分散，按照優(yōu)選的純化方法純化華中枸骨葉總黃酮，平行重復試驗3次，測定所得總黃酮含量以及總轉移率.

1.3 華中枸骨葉總黃酮抗RA關節(jié)滑膜炎癥活性

1.3.1 細胞培養(yǎng) 人關節(jié)滑膜成纖維細胞MH7A置于含10% 滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育，取對數(shù)生長期細胞進行實驗.

1.3.2 MTT MH7A細胞懸液以每孔1×105個/mL接種于96孔板中，細胞貼壁后，分別加入含質(zhì)量濃度為0、25、50、100、200、400 μg/mL總黃酮的培養(yǎng)基處理24 h，每孔加入200 μL (0.5 mg/mL) MTT孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL/孔，于570 nm處測各孔吸光值.

1.3.3 NO的測定 MH7A細胞懸液以每孔1×105個/mL接種于96孔板中，待細胞貼壁后，設空白組、模型組(50 ng/mL TNF-α)、陽性對照組(0.054 35 μmol/L吲哚美辛)和總黃酮給藥組(低、中、高). 每孔加入50 ng/mL TNF-α和不同濃度的樣品培養(yǎng)基 200 μL，培養(yǎng)24 h，吸取上清液，按照NO測定試劑盒(Griess法)說明書方法測定吸光值，并計算各上清液中NO濃度.

1.3.4 RT-qPCR MH7A細胞懸液以每孔1×106個/mL接種于6孔板中，待細胞貼壁后，給藥分組同上，不同濃度給藥預處理2 h后，加入TNF-α(50 ng/mL) 刺激6 h. TRIZOL試劑提取細胞總RNA，總RNA用逆轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，RT-qPCR采用SYBR Greenl熒光定量PCR試劑盒進行，其他定量PCR條件為預變性95 ℃、5 min，變性95 ℃、30 s，退火60.6 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，40次循環(huán). 目標基因IL-1β、IL-6、IL-8及內(nèi)參β-actin引物序列如下：IL-1β：F 5’-CCTGTCCTGCGTGTTGAAAGA-3’，R 5’-GGGAACTGGGCAGACTCAAA-3’；IL-6：F 5’-GAACTCCTTCTCCACAAGCG-3’，R 5’-TTTTCTGCCAGTG CCTCTTT-3’；IL-8：F 5’-AAGAAACCACCGGAAGGAAC-3’，R 5’-ACTCCTTGGCAAAACTGCAC-3’；β-actin：F 5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’，R 5’-CAGCGGAACCGCTC ATTGCCAATGG-3’，平行重復3次.

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析本文中數(shù)據(jù)均表示為平均值(Mean±標準偏差SD)，SPSS統(tǒng)計軟件進行分析，Student’st檢驗，P值小于0.05或0.01被認為具有統(tǒng)計學意義，Graph Pad Prism 6.0繪制圖形.

2 結果與分析

2.1 華中枸骨總黃酮提取純化

2.1.1 標準曲線及含量測定 槲皮素和樣品的顯色溶液在320 nm處均有最大吸收峰，因此選擇λmax320 nm為測定波長. 得標準曲線方程為A=0.046 5C+ 0.020 2，R2=0.999 6，槲皮素在2.5～15 μg/mL質(zhì)量濃度與A值呈良好線性關系. 按照該方法測定華中枸骨總提取物中總黃酮含量為5.88%，RSD為0.12%(n=3).

2.1.2 堿溶酸沉法和石油醚脫脂法初步純化結果 如表1所示，華中枸骨乙醇總提取物經(jīng)堿溶酸沉法處理得到的總黃酮含量為(6.54±0.30)%，轉移率(19.98±0.19)%；經(jīng)石油醚脫脂后總黃酮含量升至(11.08±0.83)%，轉移率為(85.14±4.92)%，純化效果明顯優(yōu)于堿溶酸沉法. 因此，采用石油醚脫脂法進行初步純化，可除去多量的脂溶性色素等雜質(zhì)，以利于后續(xù)進一步采用適宜方法純化、富集總黃酮.

表1 堿溶酸沉法和石油醚脫脂法初步純化總黃酮結果 %

圖1 動態(tài)洗脫曲線圖

2.1.3 聚酰胺吸附法和大孔樹脂吸附法 聚酰胺吸附法和大孔樹脂吸附法純化結果如表2所示，石油醚脫脂后粗總黃酮經(jīng)聚酰胺柱色譜吸附后，50%乙醇洗脫總黃酮純度提高至(20.09 ± 1.77) %，總黃酮轉移率為(51.85 ± 3.05)%.以總黃酮含量為主要考察因素，結合考察轉移率，比較不同大孔樹脂純化效果，結果表明，相同醇洗脫溶劑，D101大孔樹脂純化總黃酮含量明顯偏高，采用D101大孔吸附樹脂吸附經(jīng)50%乙醇洗脫純化效果最好，總黃酮含量達到(31.58 ± 0.94)%，總黃酮轉移率為(56.84 ± 1.58)%，純化效果也明顯優(yōu)于聚酰胺吸附法. 進一步考查大孔樹脂純化洗脫劑用量，結果如圖1所示，5倍柱體積50%乙醇可將總黃酮基本洗脫完全.

表2 聚酰胺吸附法和大孔樹脂吸附法純化總黃酮結果 %

2.1.4 葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析純化 為了進一步提高總黃酮的純度，經(jīng)大孔樹脂純化后的總黃酮再經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20進一步富集純化，結果見表3，第1～5 BV流分鹽酸鎂粉反應呈陽性，合并5 BV甲醇洗脫液，測定總黃酮含量達到(55.53 ± 2.63)%，轉移率為(82.02 ± 0.46)%.

2.1.5 驗證實驗 按照優(yōu)選的純化方法重復平行試驗3次，測定所得總黃酮含量以及總體轉移率. 結果如表4所示，總黃酮平均含量達53.91%，平均總體轉移率為39.65%，該純化方法重復性良好，工藝可行.

表3 葡聚糖凝膠Sephadex LH-20總黃酮結果 %

表4 驗證試驗(n=3) %

2.2 華中枸骨葉總黃酮體外抗RA關節(jié)滑膜炎癥活性

2.2.1 對MH7A細胞存活率影響 MTT結果如圖2所示. 華中枸骨總黃酮濃度不大于200 μg/mL時，MH7A細胞存活率無顯著差異(P> 0.05)，表明華中枸骨總黃酮在濃度不大于200 μg/mL時無明顯細胞毒性，因此，在隨后的細胞實驗中樣品濃度均不超過200 μg/mL.

2.2.2 對TNF-α誘導MH7A細胞生成NO抑制作用 細胞上清液中NO濃度測定結果如圖3所示，與空白組相比，模型組NO釋放量極顯著上升(#P<0.01)，說明模型組TNF-α誘導MH7A滑膜炎癥造模成功，在給藥濃度為50 μg/mL、100 μg/mL時，總黃酮呈劑量依賴性顯著抑制NO釋放量，抑制率分別為9.84%、32.79%；給藥濃度為200 μg/mL時，能極顯著抑制NO的釋放量，抑制率67.00%.

*P<0.05 vs 空白組

#P< 0.05, ##P< 0.01 vs空白組；*P< 0.05, **P< 0.01 vs TNF-α模型組

2.2.3 對TNF-α誘導MH7A細胞IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA水平抑制作用 RT-qPCR測定結果見圖4. TNF-α誘導后，MH7A細胞IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA水平顯著或極顯著升高(#P< 0.05,##P< 0.01). 總黃酮給藥處理后，相對于模型組，華中枸骨總黃酮劑量依賴性顯著降低TNF-α誘導MH7A細胞炎癥因子IL-1βmRNA水平(#P<0.05)，給藥劑量為200 μg/mL極顯著降低IL-6和IL-8 mRNA水平(**P<0.01).

#P< 0.05, ##P< 0.01 vs 空白組；*P< 0.05, **P< 0.01 vs TNF-α模型組

3 結論與討論

黃酮類成分為多種天然藥物的主要活性成分，具有良好的藥理活性而被廣泛研究.本實驗首先比較堿溶酸沉法、石油醚脫脂法初步純化華中枸骨總黃酮，結果表明乙醇總提取物經(jīng)石油醚萃取處理，總黃酮的純度和轉移率明顯升高，既能除去大量脂溶性雜質(zhì)，又有利于后續(xù)進一步柱色譜純化.聚酰胺及大孔吸附樹脂吸附色譜在天然藥物總黃酮類成分富集純化方面應用廣泛[12-14].本實驗進一步比較了聚酰胺吸附色譜及D101, D101-1, DA201, DM301, DS401大孔吸附樹脂吸附對華中枸骨總黃酮的純化效果，結果表明非極性D101大孔吸附樹脂吸附，50%乙醇洗脫效果較好, 總黃酮含量達到31.58%.為了滿足藥理活性測試需要，需要進一步提高總黃酮的純度，經(jīng)葡聚糖凝膠 Sephadex LH-20柱進一步純化，最終得到總黃酮平均質(zhì)量分數(shù)達 53.91%，總體轉移率為39.53%，重復驗證實驗表明該方法重復性好,可作為華中枸骨總黃酮的有效富集方法.

RA是免疫介導的炎癥性疾病，關節(jié)滑膜細胞等可通過自分泌或旁分泌產(chǎn)生大量的炎性因子及炎性介質(zhì)，從而影響滑膜組織與周圍結締組織的正常形態(tài)和功能，參與RA關節(jié)損傷的病理進程[15].研究結果表明華中枸骨總黃酮能夠顯著減少TNF-α誘導人關節(jié)滑膜成纖維細胞產(chǎn)生NO水平，降低促炎因子IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA的水平，顯示抗RA關節(jié)滑膜炎癥潛力，提示總黃酮類成分可能為華中枸骨治療RA主要活性物質(zhì)基礎. 本研究為華中枸骨總黃酮的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，但其抑制RA滑膜炎癥分子機制有待進一步研究.