陳忠偉，樊怡昕，胡漢寧，魏艷紅，胡康洪，葉啟發(fā)

(1.湖北工業(yè)大學中德生物醫(yī)學中心， 工業(yè)微生物湖北省重點實驗室， 湖北 武漢 430068;2.武漢大學中南醫(yī)院檢驗科， 湖北 武漢 430071； 3.武漢大學中南醫(yī)院， 武漢大學肝膽疾病研究院， 湖北 武漢430071)

0 引言

據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)統(tǒng)計[1]，原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全世界第六大最常見的癌癥，在男性中占第五位，在女性中占第九位，也是致死率位居第二位的惡性癌癥.在世界范圍內(nèi)，約80%的肝癌是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)或丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染引起的[2].跟蹤中國人群評估發(fā)現(xiàn)，慢性乙肝病毒感染患者發(fā)生肝癌的風險比未感染人群高出約20倍[3].

在大多數(shù)情況下，HCC是在中晚期被診斷出來的，并且HCC患者的預后較差，其5年生存率不到5%[4].因此急切需要尋找肝癌的特異性生物標志物，用于診斷早期肝癌和預后分類，從而降低肝癌死亡率和醫(yī)療費用.目前推薦肝硬化患者的篩查策略包括測定血清甲胎蛋白(alapha-fetoprotein, AFP)水平和每6個月進行一次腹部超聲檢查[5].對于肝臟超聲和血清AFP篩查異常者首選的影像學檢查方法是動態(tài)增強CT和多模態(tài)MRI掃描.系統(tǒng)回顧顯示，B超的靈敏性為58%，特異性為94%，CT的靈敏性為68%，特異性為93%，而MRI的靈敏性為81%，特異性為85%[6].另外影像學檢查的可靠性受限于醫(yī)師的經(jīng)驗，以及不同人種不同年齡患者檢測結(jié)果存在差異[7].因此，尋找新的特異性標志物，從而更好地診斷或預測HCC仍然是一個重要的臨床關(guān)切.本文中就HBV相關(guān)HCC診斷和預后密切相關(guān)的外周血生物標志物研究進展作一綜述，并對其前景進行展望.

1 常見乙型肝炎病毒相關(guān)肝癌蛋白質(zhì)標志物

1.1 糖基化的α-甲胎蛋白(AFP)長期以來，α-甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)與腹部超聲廣泛應用在常規(guī)的HCC篩查中.AFP是一種由胎兒卵黃囊和肝臟產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，可結(jié)合外源和血液中的內(nèi)源性物質(zhì)[8].成年人血清AFP水平極低，一旦異常升高，則與急性肝炎、竇性腫瘤、肝細胞癌等多種癌癥有關(guān)[9].然而Yao等[10]的研究顯示，只有70% 的HCC患者在診斷時AFP水平明顯升高，即使在最佳檢測條件下，運用AFP檢測HCC的靈敏度最高也只能達到75%.鑒于此，尋求準確性更高的生物標志物具有重要臨床意義.

不同疾病產(chǎn)生的糖基化的AFP，依據(jù)糖鏈結(jié)構(gòu)上的差異，分為AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3 3種，它們在診斷早期HCC和鑒別肝病惡性情況方面，特異性高于AFP，其中AFP-L3占血清總AFP的比例與腫瘤的惡性程度有關(guān)[11].Waidely等[12]研究提出，在AFP水平正常情況下，AFP-L3的升高也可作為HCC的診斷指標.但Witjes等[13]發(fā)現(xiàn)不同的研究使用不同的標準，限制了AFP-L3的臨床運用潛能，其可靠性還需要進一步驗證.

1.2 骨橋蛋白(OPN)骨橋蛋白(osteopontin, OPN)是一種與整合素結(jié)合的糖磷蛋白，是構(gòu)成骨和牙齒細胞外基質(zhì)的重要組成部分.OPN參與了發(fā)育過程、免疫過程、致瘤過程和骨平衡過程[14].OPN在結(jié)腸癌、胰腺癌、多發(fā)性骨髓瘤和其他腫瘤中均有表達，在HCC中OPN的水平高于正常組織[15].Wan等[16]發(fā)現(xiàn)，OPN的靈敏度優(yōu)于AFP(86%>66%)，但其特異性略低于AFP(86%<95%)，認為它是一個可與AFP相媲美的潛在診斷標志物.但由于HCC異質(zhì)性限制，需進一步大樣本評估OPN臨床應用的準確性及OPN與AFP的聯(lián)合應用價值.

1.3 脫-γ-羧基凝血酶原(DCP)脫-γ-羧基凝血酶原(des-gamma carboxy prothrombin, DCP)，也稱血清異常凝血酶原Ⅱ(protein induced by vitamin K absence, PIVKA-Ⅱ)，是一種非羧基化的凝血酶原，已被證實是一種致癌因子并介導HCC增殖與侵襲[17]. Xing等[18]觀察到，和AFP相比較，無論是針對< 3 cm的小肝癌組織的診斷，還是≥3 cm的大肝癌組織的診斷，DCP的AUC值即ROC曲線下面積(area under the ROC curve, 簡稱AUC)均更優(yōu)，提示DCP 是一種能夠替代AFP的診斷指標；日本、韓國及印度批準其作為HCC的有效標志物，尤其是判斷肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和預后.但魯鳳民[19]等研究發(fā)現(xiàn)維生素K缺乏或者飲酒也會導致DCP含量升高，這在一定程度上會干擾診斷結(jié)果.Song等[20]將DCP與AFP結(jié)合診斷早期HCC，靈敏度高達94%，特異性高達98.5%.因此聯(lián)合不同的生物標志物進行檢測，能極大提高診斷效果.

1.4 磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)磷脂酰肌醇聚糖-3(glypican-3,GPC3)是一種錨定在質(zhì)膜上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖.Gao等[21]研究報道GPC3通過刺激Wnt信號通路促進肝癌生長.GPC3在黑色素瘤、神經(jīng)母細胞瘤和肝母細胞瘤中低表達，在乳腺癌、肺腺癌、膽管癌和正常肝組織中無表達，但在70%的HCC患者中高表達.Dong等[22]發(fā)現(xiàn)GPC3可能是肝癌靶向性成像診斷中的理想腫瘤標志物.Xu等[23]通過系統(tǒng)性回顧和薈萃分析發(fā)現(xiàn)，血清GPC3的靈敏度與AFP 相近(55%>54%)，但其特異性低于AFP(58%<83%).聯(lián)合AFP診斷HCC的靈敏度(85%)明顯高于單獨使用血清GP73或AFP.雖然GPC3被認為是一種新的HCC血清標志物，但由于HCC的異質(zhì)性，導致其診斷結(jié)果并不一致[24].

1.5α-L-巖藻糖苷酶(AFU)α-L-巖藻糖苷酶(alpha-L-fucosidase, AFU)是一種存在于所有哺乳動物細胞中的溶酶體酶.Yang等[25]報道血清AFU在乙型肝炎相關(guān)肝癌的患者中水平升高，且在多種肝癌篩查方法中，血清AFU是肝癌特異性標志物最突出的.Mossad等[26]研究發(fā)現(xiàn)，血清AFU和鱗狀細胞癌抗原-免疫球蛋白M復合物(squamous cell carcinoma antigen-immunoglobulin M complex, SCCA-IgM)聯(lián)合診斷時，HCC和肝硬化患者SCCA-IgM和AFU水平差異顯著，可識別沒有AFP升高情況下的HCC.因此，AFU可能發(fā)展為診斷生物標志物.

1.6 其他常用于輔助診斷HCC的抗原有癌胚抗原(CEA)、癌抗原199(CA199)、癌抗原125(CA125)、癌抗原50(CA50)及癌抗原153(CA153)等, 各醫(yī)院以多個抗原抗體的組合檢測提高HCC的診斷率，常見組合有AFP/CEA/CA199或AFP/CA199/CA125/CEA.此外，對于HBV相關(guān)HCC患者需要長期監(jiān)測HBV基因型和變異類型、血清HBe Ag、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和HBV DNA水平等.

2 新發(fā)現(xiàn)的標志物

2.1 非編碼RNA

2.1.1 微小RNA(miRNA) 微小RNA(microRNAs,miRNA)是一類小的、內(nèi)源性的非編碼RNA分子，通過負性調(diào)節(jié)靶mRNA的穩(wěn)定性或翻譯效率來調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄后表達，參與調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡多種生物學過程[27].目前miRNA被認為是最具潛力的診斷標志物，其中miR-21，miR-122在HBV相關(guān)肝病不同階段均有異常表達，并與AFP水平相關(guān).

miR-21參與肝臟的發(fā)育、分化、穩(wěn)態(tài)和代謝功能，以程序性細胞死亡蛋白4(programmed cell death 4, PDCD4)和磷酸酶張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue, PTEN)為靶點，調(diào)節(jié)細胞的凋亡抗性[28].Huang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，外周血較高水平的miR-21與肝癌分化程度、進展程度正相關(guān)，預示不良后果.

Hsu等[30]報道m(xù)iR-122是一種肝臟特有的miRNA，通過抑制ATK和MAPK等相關(guān)細胞信號通路抑制腫瘤，miR-122的缺失導致分化受阻、基因組不穩(wěn)定以及炎癥，Lou等[31]研究發(fā)現(xiàn)通過間充質(zhì)干細胞介導的miR-122轉(zhuǎn)運能提高HCC化療敏感性，有望成為肝癌化療的潛力策略.

目前利用miR-122, miR-21, miR-192, miR-223, miR-26a, miR-27a和miR-801等7種血漿miRNA的表達水平建立的肝癌診斷模型其靈敏度較AFP提高約30%，而且在AFP陰性的病患中，仍能做出準確的診斷(敏感度可達77.7%，特異度可達84.5%)[32].基于該循環(huán)miRNA模型的肝癌檢測試劑盒已經(jīng)多中心臨床實驗驗證(n=1 812)，并獲國家藥品監(jiān)督管理局三類醫(yī)療器械注冊證，已進入臨床應用.

2.1.2 環(huán)狀RNA(circRNA) 環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA) 是一種共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性非編碼 RNA 分子，不具有5’端帽子和3’端 poly(A) 尾巴，呈環(huán)狀，具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和組織特異性[33].近來研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在HCC中有不同程度的表達，在HCC的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用，可能成為HCC的診斷標志物，但其在HCC發(fā)生發(fā)展過程中起哪些關(guān)鍵作用尚不清楚.

Yu等[34]研究發(fā)現(xiàn)Cdr1as(又稱CIRS-7)通過靶向miRNA-7在肝癌中發(fā)揮癌基因作用，在肝癌組織中Cdr1as表達上調(diào)，使miRNA-7表達下調(diào).Cdr1as表達增加與肝微血管侵犯(microvascular invasion,MVI)、甲胎蛋白(AFP)水平、年齡和HCC惡化密切相關(guān).Xu等[35]研究報道Cdr1as在伴有MVI的肝癌組織中的表達與miRNA-7呈負相關(guān)，與兩個miRNA-7靶基因(PIK3CD和p70S6K)呈正相關(guān).

Yu等[36]研究發(fā)現(xiàn)cSMARCA5(也稱Hsa_CIRC_0001445)是區(qū)分HCC患者與健康對照以及肝硬化或慢性乙肝患者的相當準確的標志物.Zhang等[37]報道cSMARCA5通過海綿miRNA-17-3p和miRNA-181b-5p促進腫瘤抑制因子TIMP3，從而抑制肝癌細胞增殖和遷移.此外，cSMARCA5的低表達也可能是肝切除術(shù)后HCC患者總體生存(OS)和無復發(fā)生存(RFS)的獨立危險因素.

2.1.3 長鏈非編碼RNA 長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, LncRNA)屬于一類長達200 bp的非編碼RNA分子，廣泛存在于血漿、血清、尿液中，可作為診斷HCC或預后的潛在標志物[38].盡管LncRNA不能編碼蛋白質(zhì)，但越來越多的證據(jù)表明，它們在HCC的發(fā)展過程中，通過靶向大量的關(guān)鍵蛋白編碼基因、miRNAs和信號通路，在細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、自噬和凋亡中起重要作用[39].

當前研究中，由HBV或HBx引起LncRNAs失調(diào)較為關(guān)注的是HBx-LINE1 (fusion of the human cellular long interspersed nuclear elements and HBx)和Unigene56159，均只在HBV相關(guān)的HCC患者中表達，具有較好的特異性，是潛在的生物標志物.

Lau等[40]證實HBx-LINE1是HBV DNA和宿主序列LINE1的一種特殊的嵌合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，它證明了HBV DNA可能通過整合到宿主細胞的基因組中激活Wnt/β-catenin信號通路促進肝癌發(fā)展，并且在23.3%的HBV相關(guān)HCC患者中可檢測到該基因.Liang等[41]研究表明HBx-LINE1可以作為miR-122的分子海綿，通過耗盡miR-122，促進肝細胞β-catenin信號的激活、E-鈣黏附素的還原和細胞遷移，并導致小鼠肝細胞有絲分裂異常和肝損傷.Lv等[42]研究發(fā)現(xiàn)Unigene56159在HBV相關(guān)的HCC組織中高表達，可作為miRNA-140-5p的競爭內(nèi)源性RNA，抑制靶基因Slug的表達，從而促進HCC的細胞遷移，侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT).

2.2 病理學標志物

2.2.1 角蛋白19(keratin 19, K19) K19是病理學常用的預后標志物之一，其表達與射頻消融后的高復發(fā)率有關(guān)[43]. Govaere等[44]在韓國的HBV 相關(guān)HCC的隊列中確定K19的預后價值，它與腫瘤大小、腫瘤分化程度降低、轉(zhuǎn)移和微血管侵犯顯著相關(guān).Kawai等[45]證實肝癌中K19與轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-beta, TGF-β)途徑以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)之間的關(guān)聯(lián)，表明K19有望成為抑制TGFBR1的治療靶點.

2.2.2 上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM) EpCAM是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白.Julich-Haertel等[46]利用熒光激活細胞掃描技術(shù)發(fā)現(xiàn)EpCAM+與腫瘤惡性程度、預后不良相關(guān)，且具有作為HCC液體活檢標志物的潛力，可無創(chuàng)區(qū)分肝癌患者與慢性肝硬化患者.Takai等[47]研究確定PMPCB對線粒體穩(wěn)態(tài)的重要性，通過失活Wnt/β-catenin信號通路選擇性殺死高度耐藥的EpCAM+肝癌腫瘤.Dai等[48]采用免疫組織化學方法檢測106例接受肝切除術(shù)的HBV相關(guān)HCC患者發(fā)現(xiàn)EpCAM+與腫瘤大小、肝硬化和血管浸潤顯著相關(guān).

2.2.3 CD90 CD90是一種由不同類型的細胞表達的GPI錨定蛋白，具有調(diào)節(jié)細胞凋亡、細胞黏附、遷移、纖維化的作用[49].Xia等[50]研究發(fā)現(xiàn)CD90激活mTOR通路對阿霉素的化療耐藥.Luo等[51]研究表明CD90+細胞具有更強的致瘤性、化療耐藥性、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力，因此，CD90作為肝癌的靶向治療值得進一步研究.Zhao等[52]臨床分析顯示CD90與病理分級、衛(wèi)星病變、門靜脈癌栓和復發(fā)臨床病理參數(shù)呈正相關(guān)，提示CD90是肝切除后HCC患者預后的可靠生物標志物.

2.2.4 CD133 CD133是一種與胚胎上皮細胞質(zhì)膜突起特異相關(guān)的跨膜糖蛋白.Jang等[53]研究發(fā)現(xiàn)CD133可用于維持EGFR介導的致癌信號.此外，EGFR缺陷的CD133+肝癌細胞對抗癌藥物的敏感性高于對照CD133+肝癌細胞，表明CD133可作為新靶點對耐EGFR靶向藥物的肝癌細胞增敏.Kim等[54]發(fā)現(xiàn)在HCC中CD133的過表達預測了對索拉非尼的不良反應.Song等[55]研究提示CD133在肝癌細胞活性氧防御和逃避抗癌治療中起重要作用，此外，柳氮磺胺吡啶聯(lián)合常規(guī)化療可能是治療CD133+肝癌細胞的有效策略.

2.2.5 CD13 CD13是一種膜糖蛋白，也是一種胞外肽酶，其主要功能是將單個中性氨基酸從小肽的N端裂解出來.Sun等[56]報道CD13+/CD133+和CD13+/CD90+細胞不僅可以增強肝癌的起始性，而且可以增強對阿霉素(DXR)和氟尿嘧啶(5-FU)的化療耐藥性. 有趣的是，Yang等[57]在人肝癌細胞中發(fā)現(xiàn)，CD13不僅可以被遺傳毒性化療藥物誘導，也可以被索拉非尼誘導.Yamanaka等[58]研究臨床資料發(fā)現(xiàn)CD13的表達與E-cadherin、vientin等EMT標志物的表達密切相關(guān)，提示CD13可作為術(shù)后早期復發(fā)的預后標記物.

2.2.6 SAL樣蛋白4(Sal-like protein 4, SALL4) SALL4是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞增殖和維持多能性，Oikawa等[59]發(fā)現(xiàn)SALL4在肝癌中與細胞和腫瘤生長相關(guān)，且與5-FU耐藥有關(guān)，可抑制分化延緩腫瘤生長，表明SALL4是治療肝癌的潛在靶點.Tsujikawa等[60]通過免疫組織化學研究發(fā)現(xiàn)SALL4+的肝癌分化差，門靜脈浸潤和/或肝內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生率高，增殖活性高.

2.3 其他除了上述介紹外，研究者發(fā)現(xiàn)細胞因子類標志物具有治療HCC的潛力，例如轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)可作為肝癌治療靶標[61]；血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是肝癌治療藥物索拉非尼的靶點之一[62]；成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)有助于克服肝癌對索拉非尼的耐藥性[63]；肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)/間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子 (c-mesenchymal-epithelial transition factor, c-Met)信號通路(HGF/c-MET)的異常激活參與肝癌的發(fā)生[64]，提示抑制c-Met可能具有治療潛力.當前國內(nèi)治療c-MET陽性肝細胞癌處于Ia/Ib期臨床試驗(CTR20190632).但關(guān)于此類標志物的臨床應用方案仍需要深入探究.

另外，還有研究者發(fā)現(xiàn)循環(huán)基因和細胞類標志物也有潛力應用于HCC的診斷與預后，比如循環(huán)腫瘤細胞 (circulatng tumor cell, CTC)[65]、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)[66]、AFP-mRNA[67]、游離DNA(circulating cell-free DNA, cfDNA)[68]等，但它們的臨床有效性依然需要驗證.

3 未來趨勢與討論

3.1 多標志物多指標聯(lián)合檢測由于HCC的異質(zhì)性，并不存在一個具有100%靈敏度和特異性的單一生物標志物，因此，考慮如何科學優(yōu)化已知的潛在標志物組合是一種提高診斷準確率的方法.根據(jù)中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會出臺的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》中指出，對血清AFP陰性人群，可借助AFP-L3、PIVKA II和血漿游離微小核糖核酸(microRNA)進行早期診斷.臨床診斷HCC利用外周血蛋白質(zhì)標志物聯(lián)合非編碼RNA作為常規(guī)臨床指標已成為趨勢.

此外，在乙型肝炎相關(guān)肝癌的臨床診斷中大多數(shù)醫(yī)院將患者凝血功能指標納入治療參考，包括活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplatin time, APTT)、纖維蛋白原(fibrinogen, FIB)、凝血酶原時間(prothrombin time, PT)、凝血酶時間(thrombin time, TT)、凝血時間(clotting time，CT)和國際標準化比值(international normalized ratio，INR)等，各醫(yī)院選取其中幾項檢測，稱為凝血X項，再結(jié)合腫瘤標志物水平可實時監(jiān)測患者凝血功能與腫瘤的情況，并予以有效的治療措施進而減少肝臟相應并發(fā)癥，最大程度上降低病死率.

2018年由國家肝癌科學中心/上海東方肝膽外科醫(yī)院和廣州南方醫(yī)院等多家單位進行多中心、前瞻性萬人隊列肝癌及早期預警標志物篩查項目PerCar，該模型基于生化血清標志物(AFP、AFP-L3、DCP)、影像學(US、CT、MRI)和血漿cfDNA高通量檢測，其靈敏度高達95.7%，特異性高達93.1%，目前該研究產(chǎn)品于2020年正式上市，可用于高危人群的早篩早診以及肝癌患者的復發(fā)監(jiān)控.

3.2 未來檢測新技術(shù)蛋白芯片技術(shù)具有高通量，高敏感度，提高診斷陽性率等特點，在臨床檢測多種腫瘤標志物中具有較高應用價值.功能性成像技術(shù)是基于動態(tài)計算機斷層掃描、動態(tài)磁共振成像和擴散加權(quán)磁共振成像的方法，在肝癌早期診斷以及檢測纖維化程度或血管生成等方面的變化發(fā)揮越來越大的作用.數(shù)字化病理分析技術(shù)實現(xiàn)多人會診，客觀快速，減少個體診斷差異，在病理學方面極有應用前景.最后，單細胞監(jiān)測分析技術(shù)和人工智能(artificial intelligence, AI)在癌癥診斷方面初露鋒芒.在未來，聯(lián)合現(xiàn)代科學新技術(shù)與上述潛在生物標志物，無疑是提高臨床診斷準確性的重要手段.

3.3 標志物的科學研究方法在生物標志物研究中大規(guī)模的臨床驗證尤為重要，Liu等[69]在4 016例的臨床應用中發(fā)現(xiàn)，HCC患者血清高爾基體蛋白73(Golgi protein 73,GP73)升高與患者肝硬化背景有關(guān)，證實血清GP73不能作為HCC的診斷指標，而有可能成為診斷肝硬化的潛在指標.除此之外，還應考慮不同地區(qū)種族的生物代謝特征，Costa等[70]研究證實，骨橋蛋白(OPN)和潛在轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白(latent-TGF β binding-protein 2, LTBP2)診斷HBV相關(guān)HCC時，在相同的cut-off值下，兩種標志物的靈敏性和特異性在各種族之間均有差異.

在生物標志物研究中，cut-off值在區(qū)分陰性患者和陽性患者中具有重要作用，合理的cut-off值能降低漏診率且避免不必要的經(jīng)濟負擔和心理創(chuàng)傷，但大多數(shù)研究中，陰性血清樣本量和正常的血清樣本量均少于1 000，極少考慮解決假陽性和假陰性的影響.鑒于此，如何科學設置cut-off值仍需要繼續(xù)研究.

到目前為止，大多數(shù)血清標志物研究都是單中心、回顧性的研究，其中最大的問題是缺乏可靠的科學設計和可重復驗證的研究方法.Brazma等[71]提出需要制定標準化研究方案，以便能夠重復實驗結(jié)果，使結(jié)果更具有嚴謹性和準確性.

3.4 討論理想的腫瘤標志物除了具有高靈敏性和高特異性, 還應具有操作方便、靈敏可靠、價格低廉、微創(chuàng)甚至無創(chuàng)等優(yōu)點，但生物體液中RNA的數(shù)量和質(zhì)量都很低，加大了檢測難度.在個體之間，甚至在健康人群中外周血RNA存在變異，使得可作為潛在生物標志物的外周血RNA轉(zhuǎn)換為臨床診斷指標更加復雜.因此，外周血RNA能否作為可行的生物標志物仍有很多技術(shù)瓶頸亟待解決.

肝癌發(fā)展過程極為復雜結(jié)果極為嚴重，需要更全面更系統(tǒng)的研究，未來在臨床上尋找患者亞類的生物標志物可能有更好的診斷與治療效果.雖然聯(lián)合診斷提高了靈敏度和特異性，但也增加了患者的經(jīng)濟負擔，現(xiàn)實往往需要兼顧治療效果和患者經(jīng)濟能力.總而言之，對肝癌腫瘤標志物研究并開發(fā)新型有效的標志物仍然道阻且長.