解鴻翔，曹文靜，謝姝惠，郭建壯，李曉鳳，呂士玉，馬建萍，劉翠萍(1.浙江省人民醫(yī)院 杭州醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院檢驗中心，杭州10014；2.山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 a.檢驗醫(yī)學科，b.保健綜合科，濟南 250014；.臺州學院醫(yī)學院，浙江臺州 18000)

霍亂弧菌(Vibriocholerae)是一種致病性的革蘭陰性桿菌，廣泛存在于地表的各類水域生態(tài)系統(tǒng)。根據菌體表面O抗原可將霍亂弧菌分為200多個血清群，其中只有O1和O139群可以引起霍亂的暴發(fā)或流行[1]。非O1/O139群霍亂弧菌(non-O1/non-O139Vibriocholerae，NOVC)是除O1群和O139群以外血清群的總稱，常引起輕到中度的胃腸炎、菌血癥、中耳炎和傷口感染等[2]。雖然在形態(tài)和生化反應上與O1群和O139群霍亂弧菌沒有區(qū)別，但NOVC菌株一般缺乏產毒性霍亂弧菌的幾個主要的毒力因子，如霍亂毒素(cholera toxin，CTX)和毒素共調節(jié)菌毛(toxin coregulated pilus，TCP)，其致病性與其他毒力因子有關，包括溶血素(hemolytic cytolytic A，hlyA)、血凝素蛋白酶(hemagglutinin protease，hap)、熱穩(wěn)定腸毒素(heat stable enterotoxin，ST)、RTX毒素(repeat-like toxin，rtx)、6型分泌系統(tǒng)(type Ⅵ secretion system，T6SS)等[3]。近年來，NOVC引起腸道外侵襲性感染的報道逐漸增多[3-4]，但口腔感染NOVC的病例仍然非常罕見。本研究鑒定了1株導致食管癌術后放化療患者口腔感染的NOVC，并對其病原生物學特征進行分析。

1 材料與方法

1.1病歷資料及菌株來源 患者男，51歲，因“發(fā)現血小板減少10余天”于2019年10月8日就診山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院?；颊呤銎饺障彩臭~蝦，10余天前因進食海蝦后出現發(fā)熱(體溫高達38.5 ℃)、腹痛、腹瀉而就診于當地醫(yī)院。當時腹瀉1 d,10余次,水樣便，并很快于口唇及臉頰內側出現多發(fā)血泡，易破潰，上下唇內側黏膜和上腭黏膜廣泛糜爛，融合成片狀并上覆偽膜，舌底出現較大潰瘍面，疼痛明顯，影響進食。當地醫(yī)院給予抗感染、止瀉、升白細胞及升血小板等治療，患者體溫正常，腹瀉好轉，但血小板始終未有升高，為求進一步診療入住我院。既往“食道癌術后”，已行化療12次，放療27次?；颊呷朐簳r體溫36.8 ℃，生命體征平穩(wěn)；口唇可見血泡，口腔內可見片狀白斑，舌底可見潰瘍；雙肺叩診呈清音，聽診雙肺呼吸音粗；上腹部可見一條10 cm左右縱形疤痕，雙下肢輕度水腫，余查體未見明顯異常。患者入院后出現反復發(fā)熱，胸部CT提示雙肺炎癥，實驗室檢查：WBC 3.34×109/L，Neu 2.71×109/L，RBC 2.03×1012/L，Hb 75.0 g/L，PLT 13×109/L，清蛋白34.80 g/L，C反應蛋白25 mg/L，降鈣素原0.156 ng/mL，曲霉菌抗原檢測、真菌G試驗、血培養(yǎng)均陰性，大便常規(guī)、大便培養(yǎng)、尿常規(guī)、肝功能生化指標、腎功能生化指標、電解質等未見明顯異常。留取患者口腔拭子進行細菌培養(yǎng)，結果回報NOVC生長。給予頭孢哌酮/舒巴坦控制感染及預防出血、糾正貧血、刺激骨髓造血等對癥支持治療，患者體溫降至正常，口腔感染癥狀明顯好轉。

1.2主要儀器與試劑 全自動基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)分析儀及配套試劑(德國布魯克公司)，Qubit 2.0熒光計(美國賽默飛世爾公司)，NovaSeq PE150測序儀(美國Illumina公司)；血瓊脂平板和弧菌選擇性培養(yǎng)基(TCBS，濟南百博公司)，O1、O139群霍亂弧菌診斷血清(寧波天潤公司)，藥敏紙片(英國Oxoid公司)，SDS(國藥試劑有限公司)，Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina試劑盒(美國NEB公司)。

1.3細菌分離培養(yǎng) 取患者上下唇內側黏膜和上腭黏膜糜爛處分泌物接種于血瓊脂平板中，置35 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，48 h后取菌落涂片進行革蘭染色鏡檢。

1.4MALDI-TOF MS鑒定 用接種環(huán)取少量血瓊脂平板上生長的單個菌落均勻涂布于MALDI靶板，自然干燥；加入1 μL基質液，待自然干燥后放入質譜儀進行檢測。根據待測菌圖譜與數據庫中特征主峰譜的對比情況進行鑒定，并用分數表示：分值2.300～3.000表示完全可靠的鑒定到種水平，2.000～2.299表示鑒定到種水平，1.700～1.999表示鑒定到屬水平，0.000～1.699表示沒有可靠的鑒定結果。

1.5血清群鑒定 血平板上取適量單個菌落，分別與O1群、O139群霍亂弧菌診斷血清充分涂勻，進行玻片凝集試驗，以生理鹽水作陰性對照。

1.6藥物敏感試驗 根據2016年美國臨床和實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)發(fā)布的M45文件中對霍亂弧菌的藥敏試驗要求進行K-B法藥敏試驗。

1.7基因組分析 用SDS法提取樣本基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和完整性，用Qubit熒光計進行定量[5]。檢測合格的DNA樣品進行文庫制備、Illumina NovaSeq PE150測序。對原始測序數據(Raw Data)進行過濾處理，去除包含Adapter的序列及低質量數據。將得到有效數據(Clean Data)使用SOAP denovo[6]、SPAdes[7]、ABySS[8]組裝軟件進行組裝，并最終使用CISA[9]軟件進行整合；用gapclose(Version：1.12)等軟件對初步組裝結果進行優(yōu)化和補洞，從而得到最終組裝結果。具體測序和組裝過程由北京諾禾致源公司完成。將原始測序數據比對到組裝好的基因組序列上，通過統(tǒng)計組裝序列的GC含量和測序深度，總結基因組的GC偏向性和重復序列情況。分別將組裝好的序列上傳至核糖體多位點序列分型(ribosomal multilocus sequence typing，rMLST)數據庫(https://pubmlst.org/species-id)及JspeciesWS數據庫(http://jspecies.ribohost.com/jspeciesws)，進行菌種識別和平均核苷酸相似度(average nucleotide identity，ANI)分析。用GeneMarkS軟件進行編碼基因預測及過濾，使用Diamond軟件將目標物種的氨基酸序列與非冗余蛋白質數據庫(Non-Redundant Protein Database，NR)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)注釋進行比對，可進一步得到物種信息[10]。

1.8毒力基因分析 用Diamond軟件，將目標物種的氨基酸序列分別與VFDB數據庫[11](Virulence Factors of Pathogenic Bacteria，http://www.mgc.ac.cn/VFs)和PHI數據庫[12](Pathogen-Host Interactions databas，http://www.phi-base.org)進行比對，將目標物種的基因和其相對應的毒力因子功能注釋信息結合起來，得到毒力基因注釋結果。

1.9多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST) 將組裝好的測序文件與PubMLST數據庫(http://pubmlst.org/vcholerae/)中相應的7個管家基因adk、gyrB、mdh、metE、pntA、purM、pyrC進行序列比對，從而確定其序列型(sequence type，ST)。根據該菌株的ST，用PubMLST數據庫對該菌株最小生成樹進行分析。

2 結果

2.1細菌形態(tài)特征 口腔拭子接種于血瓊脂平板經35 ℃培養(yǎng)18～24 h后見可疑菌落生長。取該菌落涂片革蘭染色，鏡下顯示革蘭陰性微彎曲的桿菌(圖1A)。該菌落轉種于血瓊脂平板和TCBS培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，該菌在2種培養(yǎng)基中均生長良好，血瓊脂平板上菌落較大，呈灰綠色、有β溶血環(huán)的濕潤菌落(圖1B)，在TCBS平板上呈黃色大而濕潤的菌落(圖1C)。

注：A，革蘭染色；B，血瓊脂平板；C，TCBS平板。

2.2質譜鑒定與血清群分型 菌株經MALDI-TOF MS鑒定為霍亂弧菌，鑒定分值為2.151。血清凝集試驗結果顯示，該菌與O1群、O139群霍亂弧菌診斷血清均未發(fā)生凝集反應，鑒定為NOVC。

2.3分子生物學鑒定 測序深度和覆蓋度顯示該樣品平均測序深度213，覆蓋度99.99%，測得DNA長度為4 018 291 bp，GC含量為44.93%。GC-Depth分析顯示，該樣品測序擴增時不存在明顯的GC偏向，組裝中無明顯的錯配及污染序列，見圖2A。將組裝好的序列上傳至PubMLST網站的rMLST數據庫進行菌種識別，結果顯示上傳序列與霍亂弧菌吻合度為100%。將序列上傳至JspeciesWS數據庫進行ANI分析，ANIb值為96.05%，ANIm值為96.56%。將測序序列用NR數據庫進行基因注釋，共得到霍亂弧菌相關的基因2 981個，見圖2B。

注：A，GC-Depth分析；B，NR注釋分析。

2.4藥敏試驗結果 該菌對哌拉西林中度敏感，對哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、慶大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、亞胺培南、美羅培南均敏感。

2.5毒力基因分析 基因組重測序結果顯示，該菌株不存在ctxAB、tcpA、zonulaoccludenstoxin(zot)、accessorycholeraenterotoxin(ace)及st等毒力基因，毒素表達調控蛋白基因(toxinregulatorygene，toxR)、hlyA、唾液酸酶基因(neuraminidaseH，nanH)、hapA、甘露醇敏感血凝素(mannosesensitivehemagglutinationA，mshA)、外膜蛋白粘附因子(outermembraneproteinU，ompU)、rtxC以及T6SS等基因為陽性。

2.6MLST分型 該菌株7個管家基因在數據庫內均能找到相對應的等位基因數值，分別為adk17、gyrB5、mdh51、metE31、pntA34、purM6、pyrC29，但未有對應的序列分型。將原始的測序結果及整理后的堿基序列提交PubMLST網站，得到新的ST型為ST-986，并進行最小生成樹分析。見圖3。

注：ST顯示為圓圈，每個圓圈的大小表示此特定類型中分離株的數量；2個圓圈之間的線上的數字代表2種類型的不同數量。

3 討論

該患者以腹瀉、腹痛伴發(fā)熱起病，并很快出現口腔感染癥狀?；颊咴诋數蒯t(yī)院經抗菌藥物治療后腹痛、腹瀉好轉，為繼續(xù)治療放化療引起的繼發(fā)性血小板減少入住我院。入院后口腔拭子細菌培養(yǎng)檢出NOVC。研究表明，由NOVC引起的感染在免疫缺陷患者中更為常見，特別是肝硬化、糖尿病、血液系統(tǒng)疾病和惡性腫瘤患者[2]。本病例為食管癌術后放化療患者，屬NOVC高危易感人群。放化療導致的骨髓抑制、免疫力低下和口腔黏膜損傷可能是患者口腔感染NOVC的重要原因。患者平日喜食魚蝦，考慮本病例中感染的NOVC可能來源于受污染的食物。

NOVC口腔感染雖然不會致命，但可引起患者口腔疼痛，影響進食，降低患者生活質量。研究表明，Bruker Biotyper MALDI-TOF MS系統(tǒng)具有準確識別致病性弧菌種類的能力[13]。本研究首先通過該技術快速地從物種水平鑒定為霍亂弧菌。rMLST是一種基于核糖體的多位點序列分型，可進行菌種識別[14]。ANI即平均核苷酸一致性，主要用于在全基因組水平評估物種間的親緣關系，ANI值超過95%被視為界定種的標準[15]。NR數據庫可以把目標物種的基因和其相對應的功能注釋信息結合起來[10]。我們通過rMLST、ANI分析和NR比對，進一步從分子生物學角度證實該菌為霍亂弧菌。

在本研究中，該菌株對臨床常用的抗菌藥物均敏感，患者經過頭孢哌酮/舒巴坦治療恢復良好。該患者入院后的大便培養(yǎng)和血液培養(yǎng)中均未檢出霍亂弧菌，可能與患者入院前經過了一段時間的抗菌藥物治療有關。同時，該患者在當地醫(yī)院治療時未行大便培養(yǎng)，因此錯失了從大便中分離出霍亂弧菌的機會。國內Wu等[16]報道已有少數NOVC菌株攜帶編碼超廣譜內酰胺酶(ESBL)基因而對第三代頭孢菌素耐藥現象。印度和越南的研究顯示，臨床和環(huán)境中分離的NOVC菌株已經出現NDM-1金屬酶介導的碳青霉烯酶抗性[17]。因此，根據藥敏試驗結果制定治療方案仍然十分重要。

雖然本文檢出菌株缺乏ctxAB、tcpA、zot、ace及st等主要毒力基因，但其含有可能編碼其他輔助毒力因子的基因，如toxR、hlyA、nanH、hapA、mshA、ompU、rtxC以及T6SS等。這些毒力因子可能提高該菌株的致病性，并在感染過程中發(fā)揮協同作用。由于現有數據庫毒力基因信息數量的局限，該菌株是否存在其他的毒力基因仍需進一步分析，每種已知的毒力基因在患者口腔感染中的具體機制仍需進一步研究。此外，我們還進一步通過MLST對該菌株進行研究，以確定其遺傳異質性。MLST結果表明我們鑒定的NOVC為新的序列型(ST986)。該菌株與我國最為流行的ST80(adk2、gyrB5、mdh45、metE56、pntA6、purM36、pyrC51)有6個基因座差異，可引起散發(fā)感染。Luo等[18]報道ST80是我國浙江省腹瀉患者糞便中分離的NOVC菌株優(yōu)勢克隆。在PubMLST數據庫中，與該菌株最相似的ST是ST209(adk17、gyrB5、mdh51、metE31、pntA34、purM11、pyrC29)，該型首次在我國山東省發(fā)現，分離自膽汁標本；另有1株分離自痰培養(yǎng)標本的NOVC(ST210)，與本株進化上有較大差異。由此可見，NOVC的序列類型可能在我國具有明顯的地域特征。

綜上所述，本研究檢出1株ST-986的新型非O1/O139群霍亂弧菌，揭示腫瘤化療患者口腔感染該型NOVC的可能性，并提示一些輔助毒力因子可能在該菌株的致病性中起重要作用。雖然NOVC引起的口腔感染罕見，但臨床醫(yī)生應警惕免疫力低下患者感染這種病原體的可能性。