張?jiān)汽?，王鑫，邵玲，曲波，趙鴻梅(遼寧省人民醫(yī)院 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，沈陽(yáng) 110016)

新型冠狀病毒(2019-nCoV)是β屬單股正鏈RNA病毒，巢病毒目，冠狀病毒科[1]，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中指出新型冠狀病毒肺炎確診病例的診斷標(biāo)準(zhǔn)為有流行病學(xué)史和臨床表現(xiàn)的疑似病例同時(shí)具備病原學(xué)或血清學(xué)證據(jù)之一者。常用的病原學(xué)檢測(cè)證據(jù)即為實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)2019-nCoV核酸陽(yáng)性[2]。目前，大部分醫(yī)療機(jī)構(gòu)建立了符合生物安全二級(jí)及以上標(biāo)準(zhǔn)的臨床實(shí)驗(yàn)室均已相繼開(kāi)展新型冠狀病毒核酸檢測(cè)項(xiàng)目。

根據(jù)中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)(China National Accreditation Service，CNAS)《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則及其在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明(CNAS-CL02-A009)文件要求，臨床實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展分子診斷檢驗(yàn)項(xiàng)目前必須進(jìn)行檢測(cè)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證，分子診斷領(lǐng)域中定性檢測(cè)項(xiàng)目驗(yàn)證內(nèi)容至少應(yīng)包括測(cè)定下限、特異性、準(zhǔn)確度、抗干擾能力等[3-4]。本研究按照CNAS-GL039《分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》[5]，對(duì)中山大學(xué)達(dá)安公司生產(chǎn)的2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行性能驗(yàn)證，評(píng)價(jià)結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1樣本來(lái)源 2019-nCoV RNA液體性能驗(yàn)證參考品(廣州邦德盛公司)。濃度為2.0×106copies/mL及2.0×105copies/mL的2019-nCoV RNA假病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)分別為GBW(E)091133及GBW(E)091132。

1.2試劑和儀器 核酸提取試劑、2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑(中山大學(xué)達(dá)安公司)；DA3200核酸提取儀(中山大學(xué)達(dá)安公司)，ABI 7500實(shí)時(shí)熒光PCR 儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

1.3方法 按照核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行核酸提取，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR測(cè)定按照2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑說(shuō)明書(shū)操作，用ORF1ab基因和N基因作為檢測(cè)靶標(biāo)基因。實(shí)驗(yàn)條件：50 ℃ 15 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。使用PCR擴(kuò)增設(shè)備配套軟件(Real-Time PCR軟件v2.4)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)擴(kuò)增曲線，規(guī)定合適基線(一般起始設(shè)定為3，終止設(shè)定為15)和熒光閾值，得到不同通道循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為FAM和VIC通道有明顯擴(kuò)增曲線，且Ct≤40；陰性標(biāo)準(zhǔn)為FAM和VIC通道無(wú)擴(kuò)增曲線或Ct值>40，且Cy5通道有擴(kuò)增曲線；如僅在FAM或VIC單一通道Ct值≤40，另一條通道無(wú)擴(kuò)增曲線，則結(jié)果需復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果一致可判為陽(yáng)性，復(fù)檢均為陰性則為陰性。

1.4性能驗(yàn)證方法及指標(biāo)

1.4.1符合率 使用相同檢測(cè)方法的ISO15189認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室作為參比實(shí)驗(yàn)室，選取陰性樣本10例、陽(yáng)性樣本10例。按照患者樣本檢測(cè)程序與參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比對(duì)，以參比實(shí)驗(yàn)室結(jié)果為準(zhǔn)，計(jì)算本實(shí)驗(yàn)室與參比實(shí)驗(yàn)室的總符合率、陽(yáng)性符合率和陰性符合率[5]。

1.4.2檢出限 待驗(yàn)證試劑盒說(shuō)明書(shū)中聲明的檢出限為500 copies/mL。使用2019-nCoV RNA假病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與用于稀釋的不含有2019-nCoV RNA、無(wú)基質(zhì)效應(yīng)的核酸保養(yǎng)液共同制備的2019-nCoV RNA陽(yáng)性樣本，濃度分別在2.0×106copies/mL、2.0×105copies/mL、2.0×104copies/mL、2.0×103copies/mL、5.0×102copies/mL、2.5×102copies/mL和1.25×102copies/mL 7個(gè)水平，在定性結(jié)果為陽(yáng)性、濃度水平最低的標(biāo)本所對(duì)應(yīng)的濃度值即為該試劑的檢出限，該檢出限符合試劑說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)且每份樣本重復(fù)測(cè)定5次，100%檢出靶核酸，則檢出限驗(yàn)證合格。

1.4.3交叉反應(yīng) 驗(yàn)證與檢測(cè)對(duì)象可能存在交叉反應(yīng)的核酸物質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響，主要指檢測(cè)對(duì)象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似臨床癥狀的病原體核酸。本實(shí)驗(yàn)使用的分析特異性參考品來(lái)自廣州邦德盛公司生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。每份分析特異性參考品重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果都為陰性則交叉反應(yīng)驗(yàn)證合格。

1.4.4精密度 檢測(cè)濃度水平分別為2.0×103copies/mL和2.0×105copies/mL的精密度參考品，添加空白對(duì)照，每份樣本重復(fù)測(cè)定2次，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算各靶基因Ct值的變異系數(shù)(CV)，評(píng)價(jià)批間不精密度；同一份樣本重復(fù)測(cè)定10次，計(jì)算Ct值的CV，評(píng)價(jià)重復(fù)性(批內(nèi)不精密度)。精密度符合說(shuō)明書(shū)聲明范圍則驗(yàn)證合格[6]。

1.4.5抗干擾能力 檢測(cè)含有內(nèi)源性干擾物質(zhì)血紅蛋白30 g/dL和清蛋白6 g/dL、外源性干擾物質(zhì)利巴韋林+阿奇霉素100 μg/mL的濃度為2.0×103copies/mL的弱陽(yáng)性樣本，樣本來(lái)源于廣州邦德盛公司生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，與常規(guī)樣本一樣處理，重復(fù)測(cè)定3次，檢測(cè)結(jié)果為弱陽(yáng)性，則抗干擾能力驗(yàn)證合格。

2 結(jié)果

2.1符合率 本試劑檢測(cè)結(jié)果與參比實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)10例陽(yáng)性標(biāo)本(P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10)ORF1ab基因和N基因Ct值均<37，10例陰性標(biāo)本(P11、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P19、P20)均未檢出Ct值，總符合率、陽(yáng)性符合率和陰性符合率均為100%，符合率驗(yàn)證合格。

2.2檢出限 在檢測(cè)下限驗(yàn)證中，本試劑盒對(duì)2.0×106copies/mL、2.0×105copies/mL、2.0×104copies/mL、2.0×103copies/mL、5.0×102copies/mL、2.5×102copies/mL和1.25×102copies/mL 7種濃度的2019-nCoV RNA陽(yáng)性樣本的檢出率均為100%，見(jiàn)圖1。結(jié)果符合試劑說(shuō)明書(shū)聲明標(biāo)準(zhǔn)，檢出限驗(yàn)證合格。

注：A，單個(gè)樣本的檢出限驗(yàn)證；B，所有樣本的檢出限驗(yàn)證。從左至右分別為：L1，2.0×106 copies/mL；L2，2.0×105 copies/mL；L3，2.0×104 copies/mL；L4，2.0×103 copies/mL；L5，5.0×102 copies/mL；L6，2.5×102 copies/mL；L7，1.25×102 copies/mL。

2.3交叉反應(yīng) 交叉反應(yīng)驗(yàn)證中，檢測(cè)含有人冠狀病毒HCoV-OC43 RNA假病毒、人冠狀病毒HCoV-HKU1 RNA假病毒、人冠狀病毒HCoV-229E RNA假病毒、人冠狀病毒HCoV-NL63 RNA假病毒、SARS冠狀病毒RNA假病毒、中東呼吸綜合征(MERS)冠狀病毒RNA假病毒、甲型流感病毒RNA陽(yáng)性、乙型流感病毒RNA陽(yáng)性、呼吸道合胞病毒A+B型陽(yáng)性、人副流感病毒陽(yáng)性、腺病毒陽(yáng)性、腸道病毒陽(yáng)性、肺炎支原體陽(yáng)性、EB病毒陽(yáng)性、人巨細(xì)胞病毒陽(yáng)性、結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性的2019-nCoV陰性樣本，重復(fù)3次的N基因及ORF1ab基因檢測(cè)結(jié)果均為未檢出。

2.4精密度 重復(fù)性驗(yàn)證中，2.0×103copies/mL濃度水平的N基因CV為0.70%，ORF1ab基因CV為0.48%;2.0×105copies/mL濃度水平的N基因CV為1.36%，ORF1ab基因CV為0.52%。批間不精密度驗(yàn)證中，2.0×103copies/mL濃度水平的N基因CV為1.17%，ORF1ab基因CV為1.36%；2.0×105copies/mL濃度水平的N基因CV為1.72%，ORF1ab基因CV為2.39%。CV符合試劑說(shuō)明書(shū)要求標(biāo)準(zhǔn)(<5%)，精密度驗(yàn)證合格。

2.5抗干擾能力 加入內(nèi)源性干擾物質(zhì)、外源性干擾物質(zhì)的濃度為2.0×103copies/mL的弱陽(yáng)性樣本重復(fù)測(cè)定3次的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，抗干擾能力驗(yàn)證合格。

3 討論

2019-nCoV核酸檢測(cè)作為新型冠狀病毒肺炎的確診手段，在快速診斷、療效評(píng)估、疫情防控中發(fā)揮重要作用[7]。疫情突發(fā)初期，很多核酸檢測(cè)試劑一經(jīng)研發(fā)出來(lái)就投入臨床，沒(méi)有進(jìn)行足夠的性能驗(yàn)證，可能導(dǎo)致的假陰性結(jié)果使得核酸檢測(cè)在新型冠狀病毒肺炎診治中的意義被臨床醫(yī)生所質(zhì)疑[7]。而性能驗(yàn)證是保證檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠的重要基礎(chǔ)，是臨床應(yīng)用的前提，對(duì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制有重要的意義[8]。

本研究所驗(yàn)證的核酸檢測(cè)試劑基于一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)，選取2019-nCoV ORF1ab和N基因作為擴(kuò)增靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物及熒光探針(N基因探針采用FAM標(biāo)記，ORF1ab探針采用Yellow標(biāo)記)用于標(biāo)本中2019-nCoV RNA的檢測(cè)，同時(shí)包括內(nèi)源性?xún)?nèi)標(biāo)檢測(cè)系統(tǒng)(內(nèi)標(biāo)基因探針采用Cy5標(biāo)記)，用于對(duì)標(biāo)本采集、核酸提取過(guò)程及PCR擴(kuò)增過(guò)程的監(jiān)控。與兩步法相比，一步法檢測(cè)技術(shù)不僅可縮短檢測(cè)時(shí)間,更可減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中樣品交叉污染的可能性,尤其適合大批量樣本操作[9]。使用的性能驗(yàn)證參考品是以新型冠狀病毒假病毒培養(yǎng)液為原料，包含新型冠狀病毒重要特征基因核殼蛋白N基因(全長(zhǎng))、包膜蛋白E基因(全長(zhǎng))和ORF1ab(1)(全長(zhǎng))，用稀釋液稀釋制備成所需系列性能評(píng)價(jià)參考品盤(pán)，具有均勻、穩(wěn)定、與臨床樣本具有良好的互通性的特點(diǎn)。

在符合率評(píng)價(jià)中，本實(shí)驗(yàn)室與另外一家通過(guò)ISO15189認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室的符合率為100%。在交叉反應(yīng)的評(píng)價(jià)中，結(jié)果顯示該試劑盒檢測(cè)結(jié)果與2019-nCoV種屬相近或引起癥狀相似的其他病原體(人冠狀病毒HCoV-OC43、人冠狀病毒HCoV-HKU1、人冠狀病毒HCoV-229E、人冠狀病毒HCoV-NL63、SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、腺病毒、腸道病毒、肺炎支原體、EB病毒、人巨細(xì)胞病毒、結(jié)核分枝桿菌)以及人基因組DNA無(wú)交叉反應(yīng)。在精密度評(píng)價(jià)中，不同濃度水平的N基因重復(fù)性為0.70%及1.36%，批間不精密度為1.17%及1.72%；ORF1ab基因重復(fù)性為0.48%及0.52%，批間不精密度為1.36%及2.39%，符合說(shuō)明書(shū)要求標(biāo)準(zhǔn)(<5%)。在抗干擾能力評(píng)價(jià)中，樣本中內(nèi)源性干擾物血紅蛋白及清蛋白、外源性干擾物利巴韋林及阿奇霉素對(duì)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果無(wú)干擾。在檢出限評(píng)價(jià)中，結(jié)果顯示該試劑盒檢出限為125 copies/mL，雖達(dá)到廠商聲明的標(biāo)準(zhǔn)，但是仍不足以達(dá)到理想的檢出限，如果臨床醫(yī)護(hù)人員在采樣過(guò)程中未采集到足量的病毒或感染初期人口咽部病毒含量低時(shí)，都可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果假陰性[10]。在與臨床的溝通中，建議為多次復(fù)查核酸結(jié)果陰性卻有明顯臨床癥狀的患者采集深咳痰液或肺泡灌洗液來(lái)提高陽(yáng)性檢出率[11]，因此，后續(xù)試劑盒優(yōu)化的重點(diǎn)應(yīng)是如何在不降低特異性的情況下不斷提高檢出限。