陳世鋒，胡紀(jì)文，殷瑛，杜江東，唐倩青，伊茂禮，王學(xué)波，張玲，危利，孫成銘

1.煙臺毓璜頂醫(yī)院 檢驗科，山東 煙臺 264000；2.羅湖醫(yī)院集團(tuán) 醫(yī)學(xué)檢驗中心，廣東 深圳 518001；3.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071；4.東方海洋（北京）醫(yī)學(xué)研究院，北京 100071

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是能普遍感染人類的DNA皰疹病毒，易感染B淋巴細(xì)胞，機(jī)體感染EB病毒后可誘發(fā)多種疾病，與其相關(guān)的惡性腫瘤包括血液系腫瘤和非血液系惡性腫瘤。在國際癌癥研究中心1999年致癌因子的分類標(biāo)準(zhǔn)中，EB病毒已被明確列為第1類致癌物，尤其是鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）。NPC是發(fā)生于鼻咽黏膜的惡性腫瘤，是第一個被發(fā)現(xiàn)與EB病毒感染密切相關(guān)的人類癌癥，大部分角化鱗狀細(xì)胞癌和幾乎所有未分化的鱗狀細(xì)胞癌都有EB病毒的存在[1-2]。NPC在世界大部分地區(qū)是一種罕見腫瘤，發(fā)病率不到1/10萬。但是，約80%的鼻咽癌發(fā)生在中國，尤其是廣東省，成為一種區(qū)域性的高發(fā)腫瘤，發(fā)病率高達(dá)（15～50）/10萬，每年最少有80 000例新患者，死亡率達(dá)（10～13）/10萬，因此我國已將鼻咽癌列為重點預(yù)防和治療的惡性腫瘤之一[3]。

血清學(xué)改變在NPC發(fā)展過程中是一個普遍和早期的事件，很可能發(fā)生在疾病從浸潤前期到浸潤期的進(jìn)展過程中。EB病毒感染人后在不同的周期產(chǎn)生不同的抗原，包括潛伏期的核心抗原（EBNA），溶解期的衣核抗原（VCA）、早期抗原（EA）、膜抗原（MA），以及從潛伏期激活轉(zhuǎn)化為溶解期的立即早期抗原Rta和Zta。EB病毒感染患者血清中存在大量針對不同抗原的抗體，因而針對EB病毒不同抗原的特異性抗體成為NPC早期診斷的重要標(biāo)志物[4]。早期抗原（early antigens，EA）抗體的出現(xiàn)提示體內(nèi)EB病毒復(fù)制開始，幾乎不在正常人群和鼻咽癌以外的其他腫瘤患者中出現(xiàn)。為了進(jìn)一步提高國產(chǎn)EA抗體檢測試劑的性能，本研究中，我們利用生物學(xué)軟件分析EA氨基酸序列的B細(xì)胞表位分布及疏水性，選取含有優(yōu)勢表位的抗原區(qū)段進(jìn)行克隆表達(dá)，并對其診斷價值進(jìn)行了初步評價。

1 材料與方法

1.1 材料

52例經(jīng)臨床病理確診的NPC患者血清標(biāo)本和95例健康體檢者血清樣本由煙臺毓璜頂醫(yī)院檢驗科和羅湖醫(yī)院集團(tuán)醫(yī)學(xué)檢驗中心提供，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

B95-8細(xì)胞株、質(zhì)粒pBVGST-6His為本室保存；T4DNA連接酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶購自TaKaRa公司；FastStart High Fidelity PCR System購自Roche公司；DNA限制內(nèi)切酶XhoⅠ、XbaⅠ購自Promega公司；HRP標(biāo)記的抗人IgG、IgM和IgA二抗購自Bethyl公司。

1.2 EA蛋白抗原性分析及優(yōu)勢表位區(qū)段篩選

采用BIOSUN生物信息學(xué)軟件分析EB病毒EA蛋白氨基酸序列，首先輸入全長序列，然后利用B細(xì)胞表位分析功能，根據(jù)表位峰值的高低篩選確定優(yōu)勢表位區(qū)段。

1.3 EA優(yōu)勢表位區(qū)段抗原基因克隆與表達(dá)

提取含EB病毒的B95-8細(xì)胞株總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，針對不同區(qū)段設(shè)計EA優(yōu)勢表位區(qū)段抗原基因的擴(kuò)增引物EA61-F（GCCTCGAGTTCGAGGTCTCCCCTGACGCTGTGGC CGA）、EA61-R（GCTCTAGATTAATACGTGGTGAC GTAGAGATCCGGATT）、EA291-F（GCCTCGAGAG TGTTATTTTATTTAACCACGCCT）、EA291-R（GCT CTAGATTAAATGAGGGGGTTAAAGGCCTGCTT）。

引物合成及序列測定由中美泰和生物技術(shù)有限公司完成。以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段（擴(kuò)增條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個循環(huán)；72℃延伸 5 min）。將純化后的PCR產(chǎn)物連接pBVGST-6His表達(dá)載體進(jìn)行測序，將含有正確目的基因的大腸桿菌菌株誘導(dǎo)表達(dá)。

1.4 抗原純化及制備

收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，超聲波破碎，從表達(dá)菌中提取包涵體，用25 mmol/L Tris-HCl重懸洗滌沉淀，加入β巰基乙醇沸水中煮5 min，收集樣品進(jìn)行Ni柱純化。首先用平衡緩沖液（25 mmol/L TE，1% β巰基乙醇，6 mol/L尿素，pH8.5）平衡Ni柱，將粗提的包涵體加入Ni柱，用含25、250 mmol/L咪唑的洗滌液分別洗脫收集目的蛋白，最后進(jìn)行15%SDS-PAGE鑒定。

1.5 間接ELISA法建立及抗原活性鑒定

分別用碳酸鹽包被緩沖液稀釋EA優(yōu)勢表位區(qū)段抗原，濃度為 2.5 μg/mL，每孔包被 100 μL，4℃過夜；用洗液洗板 2次，200 μL/孔；加入 110 μL/孔封閉液室溫封閉6 h；用洗液洗板5次，200 μL/孔；每孔加入 200 μL 樣品稀釋液后，分別加入10 μL待測血清，室溫孵育30 min，棄液，用洗滌液洗板5次后棄液，拍干，加入100 μL/孔HRP標(biāo)記的抗人IgG/抗人IgA/抗人IgM抗體，室溫孵育20 min；用洗液洗板5次，200 μL/孔；加新鮮配制的底物溶液，100 μL/孔，室溫避光孵育10 min；加入 50 μL/孔2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀測定各孔的D450nm值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

運用GraphPad Prism 5軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，繪制ROC曲線，以約登指數(shù)最大判斷Cut-off值（臨界值），≥Cut-off值判定為陽性，＜Cut-off值判定為陰性，并計算靈敏度與特異性。

2 結(jié)果

2.1 EB病毒EA優(yōu)勢表位抗原區(qū)段的確定

利用BIOSUN生物學(xué)軟件尋找B細(xì)胞表位，根據(jù)表位分布圖確定EA優(yōu)勢表位抗原區(qū)段分別為61～200 aa（EA1）和 291～404 aa（EA2）（圖 1）。

2.2 目的基因的克隆

以B95-8細(xì)胞株總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增出目的基因，2%瓊脂糖電泳鑒定結(jié)果顯示擴(kuò)增片段分別約為420 bp（EA1）和339 bp（EA2）（圖 2）。

2.3 抗原表達(dá)、純化與鑒定

PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)雙酶切克隆至pBVGST-6His載體，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pBVGST-EA1和pBVGST-EA2，測序正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)。EA1和EA2抗原均以包涵體方式表達(dá)，Ni柱純化后獲得純化抗原，電泳鑒定結(jié)果顯示EA1和EA2相對分子質(zhì)量分別約為28.4×103和25.5×103（圖3）。

圖1 EB病毒EA抗原B細(xì)胞表位分析

2.4 抗原活性初步評價

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定

圖3 EA優(yōu)勢表位區(qū)段抗原的SDS-PAGE鑒定

表1 EA優(yōu)勢表位區(qū)段抗原活性初步評價（D450nm）

隨機(jī)選取10份臨床病理確診的NPC患者血清標(biāo)本（P1～P10）和10份健康體檢者血清樣本（N1～N10），間接ELISA 法檢測樣本，比較2種抗原的活性，結(jié)果見表1。IgG檢測，EA1優(yōu)勢表位區(qū)段抗原檢出3份陽性樣本，EA2優(yōu)勢表位區(qū)段抗原10份陽性樣本全部檢出；IgA檢測，EA1優(yōu)勢表位區(qū)段抗原檢出2份陽性樣本，EA2優(yōu)勢表位區(qū)段抗原10份陽性樣本全部檢出；IgM檢測，EA1優(yōu)勢表位區(qū)段抗原未檢出陽性樣本，EA2優(yōu)勢表位區(qū)段抗原檢出4份陽性樣本。2種優(yōu)勢表位抗原對10份健康體檢者血清樣本均檢測為陰性。由此可以看出，EA2優(yōu)勢表位區(qū)段抗原活性在IgG、IgA和IgM抗體檢測方面均顯著優(yōu)于EA1優(yōu)勢表位區(qū)段抗原；NPC患者血清中抗病毒早期抗原的IgG和IgA抗體陽性率顯著高于IgM抗體。

2.5 NPC患者血清中抗EA-IgG和IgA抗體檢測

采用活性好的EA2抗原包被酶聯(lián)板，通過間接ELISA法對全部52例經(jīng)臨床病理確診的NPC患者血清標(biāo)本和95例健康體檢者血清樣本進(jìn)行抗EA抗原IgG和IgA抗體檢測，結(jié)果如圖4，NPC患者血清中抗EA-IgG水平和抗EA-IgA水平均顯著高于健康對照組。根據(jù)ROC曲線，抗EA-IgG診斷NPC的AUC值為0.972，抗EA-IgA診斷NPC的AUC值為0.893。對于抗EA-IgG檢測，以約登指數(shù)最大時的D450nm=0.446為臨界值，抗EA-IgG對NPC檢測的靈敏度為90.38%（47/52），特異性為93.68%（89/95）。對于抗EA-IgA檢測，以約登指數(shù)最大時的D450nm=0.079為臨界值，抗EA-IgA對NPC檢測的靈敏度為65.38%（34/52），特異性為95.79%（91/95）。

3 討論

晚期鼻咽癌患者病死率極高，5年生存率僅20%左右。即使生存，也因多次放療和化療帶來的嚴(yán)重不良反應(yīng)而使患者無法同健康人一樣生活。相比而言，早期鼻咽癌治療效果好，5年生存率高于85%，放療和化療周期可以縮短而使患者少受不良反應(yīng)之苦，可見鼻咽癌早期診斷是提高治療效果、降低病死率的最好方法。鼻咽癌患者一般平均在癥狀出現(xiàn)前3年血清EB病毒抗體水平呈持續(xù)升高，連續(xù)數(shù)年檢查EB病毒抗體陽性的患者，3年內(nèi)發(fā)展為鼻咽癌者占18.5%，5年內(nèi)發(fā)生鼻咽癌者為33.3%[5-8]。因此，任何一種抗體陽性的人群要定期追蹤復(fù)查，而2種或2種以上抗體持續(xù)陽性者屬于“高危人群”，尤應(yīng)高度關(guān)注并進(jìn)行進(jìn)一步檢查。

圖4 EA優(yōu)勢表位區(qū)段抗原血清學(xué)檢測性能

EB病毒裂解期依次表達(dá)Rta、EA和VCA抗原，其中EA出現(xiàn)是EB病毒活躍增殖的標(biāo)志，與EB病毒感染進(jìn)程緊密相關(guān)[9～11]。EA-IgA和VCAIgA抗體檢測已普遍應(yīng)用于鼻咽癌篩查和輔助診斷[12]，在鼻咽癌流行地區(qū)聯(lián)合檢測2種抗體使得我國鼻咽癌的早期診斷率從20%～30%提高到80%～90%。但是，由于EA-IgA抗體陽性率較低，Sigel等[13]認(rèn)為在鼻咽癌低發(fā)區(qū)EA-IgA對鼻咽癌診斷，特別是早期診斷無幫助。肖錫賓等[14]同樣認(rèn)為，在鼻咽癌高發(fā)區(qū)EA-IgG與VCA-IgA聯(lián)合檢測比EA-IgA與VCA-IgA組合能篩查出更多的鼻咽癌患者。此外，多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者EA-IgG抗體陽性率高于EA-IgA抗體，認(rèn)為EAIgG抗體是鼻咽癌篩查診斷的重要標(biāo)志物[15-16]。

本研究為了獲得高活性EA抗原，通過生物學(xué)軟件分析選取了2個優(yōu)勢表位區(qū)段抗原并獲得了高效表達(dá)，隨后經(jīng)小樣本驗證，確定其中位于EA羧基端的優(yōu)勢表位區(qū)段抗原EA2具有更好的檢測性能，既保證了抗原的活性，又具有較高的特異性。接下來放大樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示基于本研究優(yōu)勢表位區(qū)段抗原EA2所建立的EAIgG和抗EA-IgA檢測方法可以很好地區(qū)分NPC患者和健康對照，尤其是抗EA-IgG檢測的AUC值為0.972，具有優(yōu)異的檢測性能。

在本研究中，抗EA-IgG（93.68%）和抗EAIgA（95.79%）檢測的特異性均較高，兩者之間比較無顯著性差異，但是在NPC患者中抗EA-IgG的陽性率（90.38%）卻顯著高于抗EA-IgA的陽性率（65.38%），這表明與抗EA-IgA相比，EA-IgG抗體也是診斷鼻咽癌的特異性標(biāo)記物，而且具有更高的診斷性能。以往也有研究認(rèn)為EA-IgA陽性在正常人群中罕見，具有很高的特異性，但靈敏度較低，因此多與VCA-IgA聯(lián)合使用[17-18]。根據(jù)本研究結(jié)果綜合考慮，抗EA-IgG比抗EA-IgA對NPC的鑒別診斷更有價值，在篩查方案中可以考慮用抗EA-IgG代替抗EA-IgA，與其他指標(biāo)組合，提高診斷效率和篩查準(zhǔn)確率。