趙婧，岳鵬，邢國(guó)征，于洪遠(yuǎn)

1.北京航天總醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100076；2.解放軍總醫(yī)院 京北醫(yī)療區(qū)陽(yáng)坊門(mén)診部，北京 102205

臨床精準(zhǔn)用藥、個(gè)體化制定用藥方案已被廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐[1]。對(duì)于相關(guān)用藥的患者群體，基因檢測(cè)時(shí)機(jī)當(dāng)如何選擇將成為越來(lái)越有意義的課題。細(xì)胞色素P450是人體代謝外源性化學(xué)物質(zhì)的關(guān)鍵酶[2]，CYP2C19作為其家族成員，是人體重要的藥物代謝酶[3]，該酶基因多態(tài)性與酶活性密切相關(guān)[4]，許多內(nèi)源性底物、污染物以及大約2%的藥物都由CYP2C19催化代謝，亞洲人群中CYP2C19基因*2和*3是最主要的2個(gè)功能缺失型等位基因[5]。線粒體乙醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）是體內(nèi)參與酒精代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，也是硝酸甘油代謝中的關(guān)鍵酶[6]，該基因點(diǎn)突變后可分為野生型（GG型）和突變型（GA或AA型）。研究表明，ALDH2突變是中國(guó)人高血壓的易感因素[7-8]，并且會(huì)加速冠心病的病程進(jìn)展[9]。亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，也是同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）代謝途徑中的關(guān)鍵酶，其中以C677T位堿基突變最為常見(jiàn)[10]。

生物芯片識(shí)讀法檢測(cè)藥物基因是在臨床中廣泛應(yīng)用，特異性高于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。自2019年6月15日北京市醫(yī)改政策執(zhí)行后，藥物基因檢測(cè)收費(fèi)大幅降低，為有需要檢測(cè)的患者提供了福利。我院地處北京城南地區(qū)，相對(duì)人口流動(dòng)較小。本研究對(duì)2016～2019年本院所有檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了整理分析，對(duì)比全國(guó)其他地區(qū)統(tǒng)計(jì)結(jié)論，以進(jìn)一步了解北京市南城地區(qū)就診人群中藥物基因分型的分布情況，探討其與臨床用藥及疾病的治療關(guān)系，以期為臨床醫(yī)師提供用藥參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

通過(guò)實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)（LIS）統(tǒng)計(jì)出自2016年3月至2019年4月行藥物基因檢測(cè)標(biāo)本共計(jì)5754例，其中男性患者3350例、女性患者2419例，年齡16～107歲，平均年齡67.85歲。

1.2 材料

DNA提取純化試劑盒、CYP2C19基因檢測(cè)試劑盒（DNA微陣列芯片法）、BR-526-24全自動(dòng)雜交儀、BE-3.0生物芯片識(shí)讀儀、基因芯片圖像分析軟件（上海百傲科技股份有限公司）；SLAN-96P型PCR儀（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）。

1.3 基因擴(kuò)增及雜交

EDTA抗凝管采集外周靜脈血全血標(biāo)本，吸附柱法提取基因組DNA，配置PCR反應(yīng)體系，于PCR儀上進(jìn)行基因擴(kuò)增，擴(kuò)增出含有目的基因的大量單鏈DNA，在聯(lián)排管內(nèi)建立雜交體系，與基因芯片共同置于全自動(dòng)雜交儀中進(jìn)行雜交，雜交結(jié)束后用生物芯片識(shí)讀儀讀取基因分型結(jié)果。

1.4 CYP2C19、ALDH2、MTHFR基因型判定

應(yīng)用CYP2C19基因圖像分析軟件行數(shù)據(jù)分析，對(duì)送檢標(biāo)本基因型進(jìn)行判定。CYP2C19基因的DNA序列差異主要是外顯子4上由*1（636）變成*3（636）和外顯子5上由*1（681）變成*2（681），共6種基因型，分為快代謝型、中間代謝型和慢代謝型（表1）。

應(yīng)用ALDH2、MTHFR基因圖像分析軟件行數(shù)據(jù)分析，對(duì)送檢標(biāo)本基因型進(jìn)行判定。ALDH2、MTHFR各分為3種基因型，各基因型的酶活性有較大差異（表2）。

表1 CYP2C19基因分型

表2 ALDH2、MTHFR基因分型

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間基因型頻率及等位基因頻率的差異用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CYP2C19、ALDH2、MTHFR基因型測(cè)定結(jié)果

CYP2C19基因掃描結(jié)果顯示為6種基因型，即*1/*1、*1/*2、*1/*3、*2/*2、*2/*3、*3/*3；ALDH2基因掃描結(jié)果顯示3種基因型，即Glu504Glu（*1/*1）、Glu504Lys（*1/*2）、Lys504Lys（*2/*2）；MTHFR顯示為3種基因型，即CC、CT、TT（圖1）。

2.2 5754例藥物基因檢驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

將5754例臨床檢驗(yàn)樣本結(jié)果進(jìn)行回顧性分析（表3）。行CYP2C19基因檢測(cè)4692例、ALDH2基因檢測(cè)1006例、MTHFR基因檢測(cè)2139例，543例標(biāo)本為3種基因共檢。3種基因野生純合型分別檢出41.6%、71.1%、18.9%。

CYP2C19基因快代謝型、中間代謝型和慢代謝型檢出率分別為41.6%、45.9%和12.5%。

ALDH2中GG、GA、AA型分別檢出715、264、27例，檢出率分別為71.1%、26.2%、2.7%，提示其中26.2%不可用或慎用硝酸甘油，并且這類(lèi)人群對(duì)酒精的解毒能力差[11]；2.7%的AA型對(duì)硝酸甘油無(wú)效，且對(duì)酒精的解毒能力很差。

表3 5747例藥物基因結(jié)果回顧

圖l CYP2C19、ALDH2和MTHFR基因型掃描結(jié)果

MTHFR送檢的2139例標(biāo)本中，CC、CT、TT型分別檢出404、959、776例，分別占18.9%、44.8%、36.3%。36.3%的TT型患高Hcy血癥的風(fēng)險(xiǎn)高，葉酸治療時(shí)應(yīng)增加劑量。

根據(jù)送檢標(biāo)本類(lèi)別分析，病房送檢例數(shù)明顯高于門(mén)診，考慮與基因檢測(cè)項(xiàng)目收費(fèi)較高有關(guān)，門(mén)診患者的接受能力低于住院患者，但并不提示門(mén)診患者的需求低于住院患者，比較病房和門(mén)診檢出各基因型檢出頻率，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

根據(jù)送檢標(biāo)本性別分析，CYP2C19基因送檢標(biāo)本中女性患者占比44.1%，男性占比55.9%；ALDH2送檢標(biāo)本中女性患者占比40.6%，男性占比59.4%；MTHFR送檢標(biāo)本中女性患者占比41.3%，男性占比58.7%。3個(gè)基因送檢標(biāo)本男性均多于女性，但不同性別間各基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

按照世界衛(wèi)生組織以全球人體素質(zhì)和平均壽命的測(cè)定對(duì)年齡進(jìn)行劃分，可將人的一生分為5個(gè)年齡段，即青年（≤44歲）、中老年（45～59歲）、年輕的老人（60～74歲）、老年人（75～89歲）、長(zhǎng)壽老年人（≥90歲）。將送檢的5747例標(biāo)本按如上規(guī)則進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，可以清楚地看到各個(gè)基因型以老年人即75～89歲年齡段就診人群臨床送檢率較高。各年齡段3種基因分型的檢出頻率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。因此，建議早期確定基因型制定個(gè)體化用藥劑量，減少藥物不良后果的發(fā)生，對(duì)疾病治療及預(yù)后有積極意義。

2.3 根據(jù)臨床診斷結(jié)果統(tǒng)計(jì)

通過(guò)單因素方差分析，臨床送檢的5747例藥物基因檢測(cè)給出的診斷主要包括頭暈（1437例）、（急性）腦梗死（1444例）、高血壓（629例）、腦血管?。?33例）、心絞痛（336例）、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。?18例）、急性心肌梗死（54例）、胸痛（142例）、心悸/胸悶（97例）、支架術(shù)后（39例）、高脂血癥（108例）、糖尿?。?11例）、肺部感染/肺炎（373例）、胃炎（244例）、消化性潰瘍（197例）、消化道出血（106例）、反酸（102例）等，部分標(biāo)本同時(shí)包含如上2個(gè)以上診斷，表明目前進(jìn)行藥物基因檢測(cè)的臨床應(yīng)用較廣。以腦梗和冠心病的患者送檢率最高。

2.4 CYP2C19基因科室分布及各基因多態(tài)性

3個(gè)基因檢測(cè)中以CYP2C19收集數(shù)據(jù)最多（4692例），送檢標(biāo)本主要來(lái)自神經(jīng)內(nèi)科和心內(nèi)科（表4、5），心內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科慢代謝型檢出率分別為10.4%、11.6%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。消化科快代謝型、中間代謝性檢出率分別為38.9%、42.4%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。心內(nèi)科慢代謝基因型檢出160例，占比3.41%，CYP2C19是導(dǎo)致氯吡格雷療效減弱甚至治療失敗的主要影響因素之一[12]，提示這類(lèi)人群在使用新型抗凝藥物氯吡格雷時(shí)治療效果差，需要加大劑量或選擇其他抗凝藥物治療。神經(jīng)內(nèi)科檢出239例，慢代謝型檢出率為13.23%，抗癲癇藥物丙戊酸治療窗窄，代謝產(chǎn)物有肝毒性，這類(lèi)人群使用較小劑量或正常劑量可達(dá)到理想的治療效果。CYP2C19的基因多態(tài)性影響質(zhì)子泵抑制劑（proton pump inhibitor，PPI）類(lèi)相關(guān)藥物奧美拉唑在不同患者中的清除率[13]，4692例標(biāo)本中快代謝型及中等代謝型分別檢出1948和2156例，分別占比41.5%和46.0%。其中消化科送檢標(biāo)本中快代謝型及中等代謝型共檢出481例，占81.3%，提示這類(lèi)人群在使用奧美拉唑等藥物治療時(shí)療效差，需要增加藥物劑量或者換藥；而ALDH2突變型人群應(yīng)避免飲酒，調(diào)整生活方式降低卒中風(fēng)險(xiǎn)[11]。CYP2C19基因型是影響伏立康唑藥代動(dòng)力學(xué)的主要因素[14]，對(duì)于呼吸科、皮膚科等快代謝型（41.6%）使用抗真菌藥物伏立康唑的患者需要增加藥物使用劑量，或者調(diào)整抗真菌藥物。

表4 CYP2C19基因檢測(cè)結(jié)果科室分布[n（%）]

單核苷酸多態(tài)性分布顯示，CYP2C19基因681位點(diǎn)G＞A堿基突變率（30.2%）明顯高于636位點(diǎn)的G＞A堿基突變率（5.2%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表 6）。ALDH2（Glu504Lys）基因位點(diǎn)G＞A（1694＞318）突變率為15.8%，MTHFR（C677T）基因位點(diǎn)C＜T（1767＜2511）突變率為58.7%。

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)，各國(guó)住院患者發(fā)生藥物不良反應(yīng)的比例為10%～20%，約5%的患者死于嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)。個(gè)體化醫(yī)療最大的好處就是節(jié)約醫(yī)保費(fèi)用。隨著基因研究的不斷深入，單核苷酸多態(tài)性逐漸能更好地對(duì)個(gè)體表型差異、疾病易感性、藥物代謝能力做出解釋[8]。

CYP2C19是人體中重要的藥物代謝酶，亞洲人CYP2C19變異率明顯高于歐洲人[15]，CYP2C19*2等位基因在高加索白人中約占12%，美國(guó)黑人中約占15%，亞洲人占29%～35%[16]。本研究表明，北京南城地區(qū)CYP2C19*2等位基因占30.2%。CYP2C19*3亞洲人比例為2%～9%，其他種族人群約為1%以下，所占比例較低，關(guān)注該功能缺失基因?qū)τ趤喼奕巳旱囊饬x更大[17]。本研究結(jié)果顯示，北京南城地區(qū)CYP2C19*3比例為5.1%，提示攜帶該功能缺失的基因較多。

表5 CYP2C19基因型別科室分布頻率[n（%）]

表6 CYP2C19基因多態(tài)性分布[n（%）]

乙醛脫氫酶2是重要的乙醇代謝酶，可參與醛類(lèi)物質(zhì)的清除、能量代謝、脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等多種生理病理過(guò)程[18]。ALDH2基因多態(tài)性存在種族差異，白人罕見(jiàn)突變者，東亞人群突變者常見(jiàn)[19]。中國(guó)人群中，61%為GG型，32%為GA型，7%為AA型[20]。本研究顯示，1006例ALDH2中檢出GG型715例占71.1%、GA型264例占26.2%、AA型27例占2.7%，Glu504Lys位點(diǎn)G＞A（1694＞318）堿基突變率為15.8%。表明北京南城地區(qū)ALDH2基因突變率較低。

MTHFR與甲硫氨酸合成還原酶（MTRR）一起維持機(jī)體內(nèi)葉酸正常代謝[21]。MTHFR基因異常的人酶活性明顯降低，造成葉酸代謝障礙，導(dǎo)致新生兒神經(jīng)管畸形、唐氏綜合征、唇腭裂及心血管等疾病[22]的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯增高[22]。C677T位點(diǎn)突變是目前發(fā)現(xiàn)的該基因中最常見(jiàn)的不耐熱錯(cuò)義突變[23]。據(jù)報(bào)道，MTHFR基因C677T突變與缺血性腦血管病密切相關(guān)[24]。MTHFR C677T基因突變率在不同人種中不同，我國(guó)C677T基因型約占25%，明顯高于歐美國(guó)家[25]；Yang等[26]研究表明我國(guó)漢族人TT基因型為23.2%，且北方人群高于南方。本研究發(fā)現(xiàn)，我院MTHFR送檢的2139例標(biāo)本中，TT型776例占36.3%，明顯高于我國(guó)平均檢出率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MTHFR（C677T）基因位點(diǎn)C＜T（1767＜2511）堿基突變率為58.7%，提示北京南城地區(qū)該基因突變率高，對(duì)于高危人群或使用經(jīng)該途徑代謝的藥物應(yīng)積極檢測(cè)該基因，明確疾病風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)用藥。

本研究是對(duì)臨床送檢樣本進(jìn)行整理回顧分析，由于信息采集來(lái)自臨床標(biāo)本，非隨機(jī)對(duì)照研究，未系統(tǒng)調(diào)查研究對(duì)象飲酒史、吸煙史及藥物治療史等，存在設(shè)計(jì)缺陷，結(jié)論有一定的偏倚，還應(yīng)增加信息量，擴(kuò)充臨床資料以備進(jìn)一步研究。